La recherche sur l’interaction protéine-protéine est indispensable pour comprendre les processus physiologiques dans plusieurs domaines. Dans cette vidéo, nous introduisons une technique de digestion sur la membrane qui permet aux chercheurs d’effectuer une analyse complète des protéines liantes par la SP d’une manière pratique. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons améliorer le débit de l’analyse protéomique pour les immunoprécipices bruts parce que la séparation des protéines par électrophoresis gel polyacrylamide n’est pas nécessaire.
Commencez à conjuguer l’anticorps aux perles magnétiques, en mélangeant l’anticorps anti-GFP avec les perles dans 500 microlitres de tampon de phosphate de citrate. Faire pivoter le mélange à 50 rpm pendant une heure à température ambiante. Et puis laver les perles conjuguées trois fois avec tampon de phosphate de citrate contenant 1% polysorbate 20.
Cellules transfectées Lyse selon les instructions manuscrites. Racler le plat et transférer le lysate dans le tube à essai de 1,5 millilitre. Ensuite, dégagez le lysate en centrifugant à 15 000 x g pendant cinq minutes et recueillez le supernatant.
Préparez des perles magnétiques non étiquetées en les lavant trois fois avec 500 microlitres de tampon de phosphate de citrate. Après le lavage final, retirer le tampon et ajouter le lysate cellulaire aux perles. Faire pivoter le mélange à 50 RPM pendant 30 minutes à température ambiante.
Effectuez la séparation magnétique sur le support magnétique et recueillez le lysate cellulaire. Pour lier les protéines cibles aux perles conjuguées à l’immunoglobuline, placez les perles sur le support magnétique pendant cinq minutes. Jetez le tampon de citrate et ajoutez le lysate de cellules aux perles.
Faire pivoter le mélange pendant une heure à 50 rPM. Pour séparer les protéines cibles des protéines non cibles libres, lavez les perles trois fois avec 500 microlitres de tampon de phosphate de citrate contenant 1 % de polysorbate 20. Après le lavage final, ajouter 30 microlitres de tampon de citrate, et laisser reposer les perles pendant cinq minutes à température ambiante pour élucider les protéines cibles.
Pour préparer la membrane, couper les membranes PVDF en morceaux de 3 millimètres par 3 millimètres à l’aide de ciseaux chirurgicaux qui ont été nettoyés immédiatement avant l’utilisation. Déposer les morceaux de membrane sur du papier d’aluminium et ajouter deux à cinq microlitres d’éthanol à chaque pièce. Avant que les membranes ne soient complètement sèches, ajouter deux à cinq microlitres de la protéine élitente à chaque pièce et les sécher à l’air jusqu’à ce que la surface de la membrane devienne mate.
Transférez ensuite les membranes dans des tubes de 1,5 millilitre et stockez-les à quatre degrés Celsius. Si vous utilisez immédiatement, ajouter de deux à 30 microlitres d’éthanol qui les œuvreront hydrophiles. Retirer l’éthanol à l’aide d’une pipette, mais avant que les membranes ne sèchent, ajouter complètement 200 microlitres de solution de réaction à base de TNT à chaque tube et les incuber à 56 degrés Celsius pendant une heure.
Après l’incubation, remplacer la solution de réaction par 300 microlitres de solution iodoacetamide, et incuber dans l’obscurité pendant 45 minutes. Ensuite, lavez les membranes deux fois avec de l’eau distillée et une fois avec 2% d’acétylonitrile en vortexant pendant au moins dix secondes. Travailler avec de l’acétylonitrile diaphane peut être extrêmement dangereux.
Un masque, des lunettes et des gants doivent toujours être portés lors de l’exécution de la procédure de digestion sur la membrane. Préparer la trypsine selon les instructions manuscrites, et ajouter 100 microlitres de solution de réaction de trypsine à chaque membrane. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius pour la digestion.
Le lendemain, transférez la solution de réaction dans un tube propre de 1,5 millilitre et ajoutez 100 microlitres de solutions de lavage à la membrane. Incuber la membrane à 60 degrés Celsius pendant deux heures, puis recueillir la solution de lavage et la mélanger avec la solution de réaction. Ajouter 100 microlitres supplémentaires de solution de lavage à la membrane et sonifier pendant 10 minutes.
Ensuite, collectez la solution de lavage et mélangez-la avec la solution de réaction. Couvrir le tube à essai d’un morceau de film de laboratoire et faire de petits trous dans le film avec une aiguille. Séchez la solution à l’aide d’un concentrateur sous vide et dissolvez les résidus dans 10 microlitres d’acide 2% formic.
Centrifugeuse le tube à 12 000 x g pendant trois minutes, et transférer le supernatant dans un tube d’échantillon. Analyser l’échantillon à l’aide d’un spectromètre de masse relié à un système nano LC/HPLC. En utilisant ce protocole, 17 protéines ont été identifiées dans l’immunoprécipitar associé de Calpain-6, 15 dans l’immunoprécipice GFP-associé, et 11 ont été identifiées dans les deux.
Il est important de noter que la détection d’au moins un fragment de peptide haute fidélité est nécessaire pour l’identification positive d’une protéine candidate. Les protéines qui se sont précipitées dans le lysate exprimant le GFP ainsi que les histones, les protéines exogènes et ribosomales ont été omises de la liste. Laver les membranes avant la digestion tryptique avec de l’eau distillée et 2% d’acétylonitrile est l’étape la plus importante dans la procédure de digestion sur la membrane sur les protéines.
Suivant cette méthode, il est possible de confirmer la coprésentation des protéines cibles en menant d’autres expériences, telles que l’immunoprécipice et l’analyse des taches occidentales. Cette méthode simple permet aux chercheurs d’explorer les nouvelles interactions protéine-protéine avec une analyse pratique et hautement sensible.
