يعتبر بتر P3 نموذجًا قبل الظهارة للتحقيق في التجدد الظهاري للثدييات وأداة قوية لتحديد مجموعات الخلايا الحرجة والآليات التي تتحكم في التجدد الداخلي. نموذج P3 يسمح لتحديد مجموعات الخلايا الفجّة المبكرة والمتأخرة ، ودراسة إعادة التجمّع أثناء التجديد ، والتحقيق في القذف داخل الرحم دون متطلبات جهاز تثبيت العظام المعقدة. إظهار الإجراء معي سيكون أسامة قريشي، أليسا فالك، وكاثرين زيميل، فني، وريجينا برونايور، أستاذ باحث مساعد من مختبرنا.
بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم في فأر CD-1 يبلغ من العمر ثمانية إلى 12 أسبوعًا ، ضع المرهم على عيون الحيوان ووضع الفأر تحت مجهر تشريح 10X. استخدام جراحية بوديندون اليود و 70٪ الإيثانول لتعقيم أرقام كل طرف خلفي واستخدام microscisors لتقليم الشعر بعيدا عن موقع الجراحة. تطبيق ميكرولتر واحد من bupivacaine موضعي محليا ل التخدير في موقع الجراحة، ولعب بلطف مخلب واحد الخلفي لفضح سطح أرقام الوسيط.
ثم عقد مشرط في زاوية موازية للوحة الدهون، واستخدام مشرط معقمة رقم 10 لبتر غيض من phalanx محطة من الأرقام اثنين وأربعة. تطبيق واحد microliter إضافية من bupivacaine محليا إلى كل رقم مبتورة والعودة الماوس إلى قفص نظيف للسماح للجروح للشفاء دون خلع الملابس الجرح ومع رصد حتى إعادة شغل كامل. لضمان نجاح P3 الطائرة بتر، عقد مشرط موازية للوحة الدهون أثناء البتر وإجراء المسح الضوئي المجهرية المقطعية للتأكد من طول البتر الصحيح.
عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، استخدم مشرطًا لقطع الرقم في منتصف عظم الفلانيكس الأوسط عند المسافة البادئة للدهن البطيني الثاني تقريبًا. نقل الأنسجة إلى 20 ملليلتر قارورة التلألؤ التي تحتوي على 10 ملليلتر من الزنك الطازجة buffered formalinative لمدة 24 إلى 48 ساعة. واستخدام microtome للحصول على أربعة إلى خمسة أجزاء سميكة ميكرومتر من كل رقم، ووضع شرائح في حمام الماء 38 إلى 41 درجة مئوية تكملها مع محلول لاصق النسيجي كما يتم الحصول عليها.
ثم التقط الشرائح على الشرائح اللاصقة ووضع الشرائح على شريحة مئوية 37 درجة أكثر دفئًا حتى يجف. عندما تم deparaffinized الشرائح تزج العينات في جرة تلطيخ من حل استرجاع مستضد المناسبة، وتسخين الشرائح إلى 95 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة مع التأكد من أن الغليان لا يحدث. في نهاية الحضانة، والسماح للجرة أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة، ووضع الشرائح شقة في مربع شريحة بلاستيكية تغطي بوصة واحدة عميق مع ورق الأنسجة مبللة في القاعدة.
إضافة 100 ميكرولترات من البروتينات قبل الدفء K إلى كل عينة. تغطية كل شريحة مع شريط صغير من البارا فيلم لضمان أن المقاطع لا تصبح جافة. بعد 12 دقيقة في 37 درجة مئوية، وإزالة بعناية فيلم البارافين، واستنزاف بلطف الشرائح على ورق الأنسجة لإزالة حل منع الزائدة.
بعد ذلك، إضافة 100 إلى 200 ميكرولترات من الحل الأجسام المضادة الأولية التي تهم كل شريحة. العودة إلى المواقع إلى غرفة الترطيب مغطاة فيلم البارافين لاحتضان ليلة وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي بعد غسل الشرائح في المالحة TRIS المخزنة بالإضافة إلى TWEEN أو TBST التسمية الشرائح مع حل مناسب للأجسام المضادة الثانوية لاحتضان 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح في TBST والسماح لهم لتجف. ثم استخدام 100 microliters من مضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة لوضع بعناية أغطية على الشرائح المجففة وتخزين الشرائح شقة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها محمية من الضوء للسماح المتوسطة تصاعد لتجف. لتسلسل في التصوير المقطعي المجهرية في الجسم الحي أو micro-CT الزي التصوير المقطعي المجهري مع أنابيب لتمكين تدفق الأكسجين داخل وخارج غرفة الحيوانات التصوير المقطعي الصغرى، والتأكد من أن الأكسجين الخارج مجهز مع مرشح الفحم المنشط لاصطياب isoflurane.
تعيين Voxelsize إلى 10.5 ميكرومتر في 55 كيلوفولتاج الذروة و 145 ميكرومبير مع 1،000 الإسقاطات لكل 180 درجة وتناوب مستمر مع وقت التكامل من 200 ميلي ثانية، مما أدى إلى حد أقصى 213 شرائح لكل مسح. عندما يكون الماسح الضوئي جاهزًا، ضع الفأر المُجَنَّد بلطف في غرفة الحيوانات المُصغرة المقطعية مع أرقام الأطراف الخلفية مرتبة في جانب بطني مسطح وثيق مع الكف الأيسر على الجانب الأيسر واليسرى على الجانب الأيمن من منصة المسح الضوئي. ثم تطبيق الشريط الجراحي لتأمين بلطف الأرقام في مكان.
ضع مرهم العيون على عيون الحيوان قبل بدء الفحص. بعد المسح الضوئي، قم بإعادة الحيوان إلى قفص نظيف مع المراقبة حتى إعادة شغل الوظائف بالكامل، والسماح لعدة ساعات لإعادة بناء صورة التصوير المقطعي الصغرى. لتحليل صورة العظام ثلاثية الأبعاد التي أعيد بناؤها ، وذلك باستخدام البرنامج المقدم مع التصوير المقطعي المصغر ، قم بتحويل ملفات الصور إلى سلسلة من ملفات DICOM.
عندما يتم تحويل كافة الملفات، قم بتنزيل سلسلة DICOM في مجلد واحد باستخدام تنزيل ملف دفعي في مستعرض ويب. قم بتحميل المكون الإضافي BoneJ في مجلد المكونات الإضافية ImageJ. سحب و-أفلت المجلد سلسلة ملف DICOM إلى شريط ImageJ لفتح الملفات.
سيتم فتح رصة صورة 16 بت تعرض كافة القيم الرمادية. لعرض العظم فقط، انقر فوق ضبط الصورة والعتبة. حرك شريط العتبة العلوي إلى أقصى اليمين واضبط شريط العتبة السفلي حتى يتم تمييز العظم باللون الأحمر فقط.
ستكون قيمة العتبة الأدنى حوالي 10,000 إلى 13,000 عند أقصى كثافة إشارة 32,767. انقر فوق تطبيق وفي مربع الحوار الجديد، انقر فوق خلفية سوداء. بعد ذلك، انقر فوق موافق. سيتم إنشاء صورة ثمانية بت عرض قيم بالأسود والأبيض.
مع الأبيض المقابلة للعظم. رسم مستطيل حول العظام P3 لتحديده وتكرار المكدس. لإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد، انقر فوق الإضافات والمشاهد ثلاثي الأبعاد واستخدم أداة التحديد اليدوي للدائرة في العظم الذي سيتم حذفه.
ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحدد اختيار التعبئة لاحصد أي عظمة غير ضرورية من الصورة. لتحديد حجم العظام من التقديم ثلاثي الأبعاد، افتح المكون الإضافي BoneJ وحدد كسور الحجم. ستظهر نافذة نتائج، كما سيظهر حجم العظام في ملليمترات مكعبة.
لتحديد طول العظام من التقديم ثلاثي الأبعاد، استخدم أداة ImageJ متعددة النقاط. لالتقاط صورة للعرض ثلاثي الأبعاد، انقر فوق عرض وأخذ لقطة. ثم احفظ الصورة كملف TIF أو JPEG.
في هذه الصور كانت أجزاء من فأر بالغ تجديد P3 مناعة مع الأجسام المضادة لتصور تجديد العظام داخلmembranous وتشكيل البلاستيما في اليوم السادس إلى السابع وتسعة و 10 بعد البتر. هنا، تظهر عروض التصوير المجهرية المجهرية للأرقام التي تم مسحها ضوئيًا قبل البتر وفي نقاط زمنية مختلفة على مدار التجديد مع المعالم المستخدمة لتحديد قياسات الطول. نموذج رقم الماوس هو نظام قوي لتحليل بيئة جرح مؤيدة للتجديد الذي يؤدي إلى تشكيل البلاستيما عند بترها على مستوى أدنى.
وعلى العكس من ذلك، فإن بتر الأرقام في مكان قريب هو بمثابة نظام نموذجي للتحقيق في الفشل التجديدي، فضلا عن موقع لاختبار استراتيجيات تعزيز التجديد.
