קטיעה P3 היא מודל פרה-קליני לחקירת התחדשות אפימורפית של יונקים וכלי רב עוצמה לזיהוי אוכלוסיות תאים קריטיות ומנגנונים השולטים בהתחדשות אנדוגנית. מודל P3 מאפשר זיהוי של אוכלוסיות תאים בלסטמליות מוקדמות ומאוחרות, חקר revascularization במהלך התחדשות, ואת החקירה של ossification תוך-ממברני ללא דרישות התקן ייצוב עצם מורכבות. הדגימו את ההליך איתי יהיו אוסאמה קורשי, אליסה פאלק וקתרין צימל, טכנאית, ורג'ינה ברונאור, עוזרת מחקר פרופסור הכל מהמעבדה שלנו.
לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ בוהן בעכבר CD-1 בן שמונה עד 12 שבועות, להחיל משחה על העיניים של החיה ולמקם את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח 10X. השתמש יוד povidone כירורגית ו 70% אתנול כדי לעקר את הספרות של כל איבר אחורי ולהשתמש microscissors כדי לקצץ את השיער הרחק מהאתר הכירורגי. החל מיקרוליטר אחד של bupivacaine אקטואלי באופן מקומי כדי להרים את האתר הכירורגי, בעדינות splay כפה אחורית אחת כדי לחשוף את פני השטח ספרה המדיה.
לאחר מכן מחזיקים את האזמל בזווית המקבילה ל כרית השומן, משתמשים באזמל סטרילי מספר 10 כדי לקטוע את הקצה הדיסטלי של הפלנקס המסוף של ספרות 2 ו-4. החל מיקרוליטר נוסף אחד של bupivacaine באופן מקומי על כל ספרה קטועה ולהחזיר את העכבר לכלוב נקי כדי לאפשר את הפצעים לרפא ללא ההלבשה הפצע עם ניטור עד שליטה מלאה. כדי להבטיח מישור קטיעה מוצלח P3, להחזיק את האזמל במקביל כרית השומן במהלך קטיעה ולבצע סריקת מיקרו CT כדי לאשר את אורך קטיעה הנכון.
בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש באזמל כדי לנתק את הספרה באמצע דרך עצם הפלנקס האמצעית בערך בכניסה השנייה של כרית השומן הגחונית. מעבירים את הרקמה לבקבוקון נצנוץ של 20 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מתקן פורמלין אבץ טרי למשך 24 עד 48 שעות. ולהשתמש microtome לרכוש ארבעה עד חמישה חלקים עבים מיקרומטר של כל ספרה, הצבת הפרוסות לתוך 38 עד 41 מעלות צלזיוס אמבט מים בתוספת פתרון דבק היסטולוגי כפי שהם מתקבלים.
לאחר מכן ללכוד את הפרוסות על מגלשות דבק ולמקם את המגלשות על 37 מעלות צלזיוס להחליק חם לייבוש. כאשר השקופיות כבר deparaffinized לטבול את הדגימות בצנצנת מכתים של פתרון אחזור אנטיגן המתאים, לחמם את השקופיות ל 95 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות לוודא כי הרתיחה לא מתרחשת. בסוף הדגירה, אפשר לצנצנת להגיע לטמפרטורת החדר, והנח את המגלשות שטוחות בקופסת מגלשת פלסטיק מכוסה בעומק סנטימטר אחד עם נייר טישו לח בבסיס.
הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חלבון K לפני המלחמה לכל דגימה. מכסים כל שקופית ברצועה קטנה של פרפילם כדי להבטיח שהקטעים לא יתייבשו. לאחר 12 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להסיר בזהירות את הסרט פרפין, בעדינות לנקז את השקופיות על נייר טישו כדי להסיר פתרון חסימה עודף.
לאחר מכן, הוסיפו 100 עד 200 מיקרוליטר של פתרון הנוגדנים העיקרי שמעניין כל שקופית. החזירו את האתרים לתא הלח המרופד בסרט פרפין עבור דגירה לילית בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר לאחר שטיפת השקופיות מלוחים TRIS-buffered בתוספת TWEEN או TBST תווית השקופיות עם פתרון נוגדנים משני מתאים עבור דגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות ב- TBST ולאפשר להם להתייבש. לאחר מכן השתמשו ב-100 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד עמעום כדי למקם בזהירות כיסויים על השקופיות המיובשות ולאחסן את השקופיות שטוחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה המוגנות מפני אור כדי לאפשר למדיום ההרכבה להתייבש. עבור טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת רציף של vivo או מיקרו-CT, התלבושת המיקרו-CT עם צינורות כדי לאפשר זרימת חמצן לתוך ומחוץ לתא החיה מיקרו-CT, לוודא כי החמצן העולה מצויד במסנן פחם פעיל כדי ללכוד את isoflurane.
הגדר את ה- Voxelsize ל- 10.5 מיקרומטר ב- 55 קילו-וולטאז' שיא ו- 145 מיקרואמפ עם 1,000 תחזיות לכל 180 מעלות וסיבוב רציף עם זמן אינטגרציה של 200 אלפיות שניה, וכתוצאה מכך 213 פרוסות לכל היותר לכל סריקה. כאשר הסורק מוכן, מניחים בעדינות את העכבר הרדמה בתא החיות micro-CT עם ספרות הגפיים האחוריות מסודרות שטוח, צד גחון קשר קרוב למעלה עם הכף השמאלית בצד שמאל וימינה בצד ימין של פלטפורמת הסריקה. לאחר מכן להחיל קלטת כירורגית כדי לאבטח בעדינות את הספרות במקום.
החל משחה עיניים על העיניים של החיה לפני תחילת הסריקה. לאחר הסריקה, החזירו בעלי חיים לכלוב נקי עם ניטור עד לשיקום מלא, ואפשרו עד מספר שעות לשחזור תמונה מיקרו-CT. לניתוח של תמונת העצם 3D משוחזר, באמצעות התוכנה המסופקת עם מיקרו CT, להמיר את קבצי התמונה לסדרה של קבצי DICOM.
לאחר המרת כל הקבצים, הורד את סדרת DICOM בתיקיה אחת באמצעות מוריד קבצי אצווה בדפדפן אינטרנט. טען את יישום ה- Plug-in של BoneJ לתיקיית התוסף ImageJ. גרור ושחרר את תיקיית סידרת הקבצים DICOM לתוך סרגל ImageJ כדי לפתוח את הקבצים.
ערימת תמונות של 16 סיביות המציגה את כל הערכים האפורים תיפתח. לתצוגת עצם בלבד, לחצו על 'התאמת תמונה' ו'סף'. החלק את סרגל הסף העליון לימין הקיצוני והתאם את סרגל הסף התחתון עד שרק העצם מסומנת באדום.
ערך הסף התחתון יהיה בערך 10, 000 עד 13, 000 בעוצמת אות מקסימלית של 32, 767. לחץ על החל ובתיבת הדו-שיח החדשה, לחץ על רקע שחור. לאחר מכן, לחץ על אישור. תמונה של שמונה סיביות המציגה ערכים בשחור-לבן תיווצר.
עם הלבן המתאים לעצם. צייר מלבן מסביב לעצם P3 כדי לבחור אותה ולשכפל את הערימה. ליצירת תמונה תלת-מימדית, לחצו על 'תוספים' ו'מציג תלת-מימד' ולהשתמש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי להקיף את העצם למחיקה.
לאחר מכן לחצו לחיצה ימנית ובחרו 'מלאו את הבחירה' כדי לחתוך עצם מיותרת מהתמונה. לכימות נפח העצם מהעיבוד תלת-ממדי, פתחו את תוסף BoneJ ובחרו 'שבר נפח'. יופיע חלון תוצאות ונפח העצם יוצג במילימטרים.
לכימות אורך העצם מהעיבוד תלת-ממדי, השתמשו בכלי הרב-נקודתי ImageJ. ללכידת תמונה של הרינדור תלת-ממדי, לחצו על 'תצוגה' וצלמו תמונה. לאחר מכן שמרו את התמונה כקובץ TIF או JPEG.
בתמונות אלה קטעים של עכבר בוגר התחדשות P3 ספרות היו immunostained עם נוגדנים לדמיין התחדשות עצם תוך-מטרית היווצרות blastema ביום שש עד שבע, תשע ו 10 לאחר קטיעה. כאן, עיבודי מיקרו-CT מייצגים של ספרות שנסרקו לפני קטיעה ובנקודות זמן שונות במהלך התחדשות עם ציוני דרך המשמשים לזיהוי מדידות אורך מוצגים. מודל ספרות העכבר הוא מערכת רבת עוצמה לניתוח סביבת פצעים פרו-רגנרטיבית המפעילה היווצרות blastema כאשר נקטעה ברמה דיסטלית.
לעומת זאת, קטיעה פרוקסימלית של הספרות משמשת כמערכת מודל לחקירת כשל רגנרטיבי, כמו גם אתר לבדיקת אסטרטגיות לשיפור התחדשות.
