P3切断は、哺乳類のエピモルフィック再生を調査するための前臨床モデルであり、重要な細胞集団および内因性再生を制御するメカニズムを同定するための強力なツールである。P3モデルは、早期および後期の芽細胞集団の同定、再生中の再血管化の研究、および複雑な骨安定化装置要件のない内経的骨化の調査を可能にする。私と一緒に手順を実証するには、オサマ・クレシ、アリュサ・ファルク、キャサリン・ジンメル、技術者、レジーナ・ブルヌール、私たちの研究室から研究助教授です。
8~12週齢のCD-1マウスでつまみつまみへの反応が無いのを確認した後、動物の目に軟膏を塗布し、マウスを10倍の解剖顕微鏡の下に置きます。外科用ポビドネヨウ素と70%エタノールを使用して、各後肢の数字を殺菌し、マイクロシザーを使用して外科現場から毛髪を切り取ります。局所ブピバカインの1マイクロリットルを局所に塗布して外科的部位を麻酔し、後ろ足1本をそっとスプレイして内側の数字表面を露出させる。
次に、脂肪パッドに平行な角度でメスを保持し、滅菌番号10メスを使用して、2桁および4桁の末端ファランクスの遠位先端を切断する。切断された各桁にブピバカインを1マイクロリットル加え、マウスを清潔なケージに戻して、創傷のドレッシングなしで完全な再発まで監視して傷を癒すことができる。P3切断面を確実に確保するために、切断時にメスを脂肪パッドに平行に保持し、マイクロCTスキャンを実行して正しい切断長を確認します。
適切な実験エンドポイントで、メスを使用して、約2番目の腹側脂肪パッドのインデントで中央ファランクスの骨の途中で数字を切断します。10ミリリットルの新鮮な緩衝亜鉛ホルマリン固定液を含む20ミリリットルのシンチレーションバイアルに組織を24〜48時間移す。そして、ミクロトームを使用して各桁の厚さ4〜5マイクロメートルのセクションを取得し、スライスを38〜41度の水浴に入れ、得られるように組織学的接着溶液を加えます。
その後、接着剤スライド上のスライスをキャプチャし、乾燥するために37度の摂氏スライド暖かい上にスライドを置きます。スライドが脱パラフィン化されたら、適切な抗原検索溶液の染色瓶にサンプルを浸し、沸騰が起こらないようにスライドを摂氏95度に25分間加熱します。インキュベーションの終わりに、瓶を室温に戻し、スライドをベースに湿らせたティッシュペーパーが付いた1インチの深い覆われたプラスチック製のスライドボックスに平らに置きます。
各サンプルに100マイクロリットルのプリウォームプロテイナーゼKを加えます。各スライドに小さなパラフィルムを覆い、セクションが乾燥しないようにします。摂氏37度で12分後、パラフィンフィルムを慎重に取り出し、ティッシュペーパーのスライドを静かに排出して余分なブロッキング溶液を取り除きます。
次に、目的とする一次抗体溶液の100~200マイクロリットルを各スライドに加える。4°Cで一晩インキュベーションのためにパラフィンフィルムで覆われた加湿室にサイトを返します。翌朝、TRIS緩衝生理食肉+TWEENまたはTBSTでスライドを洗浄した後、スライドに適切な二次抗体溶液をラベル付けし、光から保護された室温で45分間インキュベーションします。
インキュベーションの終わりに、TBSTでスライドを洗い、乾燥させます。その後、100マイクロリットルのアンチフェードマウントメディアを使用して、慎重にドライスライドにカバースリップを配置し、取り付け媒体を乾燥させるために光から保護された室温で平らにスライドを保存します。シーケンシャルin vivoマイクロコンピュータ断層撮影またはマイクロCTの衣装では、マイクロCT動物室に出入りする酸素を可能にするチューブ付きのマイクロCTイメージャーを装備し、流出酸素にイソフルランをトラップするための活性炭フィルターが装備されていることを確認します。
Voxelsizeを55ピークキロ電圧で10.5マイクロメートル、180度あたり1,000投影、統合時間が200ミリ秒の連続回転で145マイクロアンペアに設定すると、スキャンあたり最大213スライスになります。スキャナーの準備ができたら、後肢の数字を平らに配置したマイクロCT動物室に麻酔マウスをそっと置き、左側の左足と右側の右側に関連付けられた腹側を閉じます。その後、外科テープを貼って、桁を静かに固定します。
スキャンを開始する前に、動物の目に眼科軟膏を適用します。スキャン後、完全な再耐えが行になるまで監視してきれいなケージに動物を戻し、マイクロCT画像再構築のために数時間まで許可します。再構築された3D骨画像の分析のために、マイクロCTで提供されるソフトウェアを使用して、一連のDICOMファイルに画像ファイルを変換します。
すべてのファイルが変換されたら、Webブラウザでバッチファイルダウンローダーを使用して、DICOMシリーズを単一のフォルダにダウンロードします。BoneJ プラグインを ImageJ プラグインフォルダーにロードします。DICOM ファイル シリーズ フォルダを ImageJ バーにドラッグ アンド ドロップして、ファイルを開きます。
すべてのグレー値を表示する 16 ビットイメージスタックが開きます。ボーンのみを表示するには、[イメージ調整としきい値]をクリックします。上部しきい値バーを右端にスライドさせ、ボーンだけが赤色にハイライトされるまで下限しきい値バーを調整します。
下限値は、最大信号強度 32,767 で約 10,000 ~ 13,000 になります。[適用] をクリックし、新しいダイアログ ボックスで [黒の背景] をクリックします。次に、[OK] をクリックします。黒と白の値を表示する 8 ビットのイメージが生成されます。
白は骨に対応しています。P3 ボーンの周囲に長方形を描いて選択し、スタックを複製します。3D 画像を生成するには、[プラグイン] と [3D ビューア] をクリックし、フリーハンド選択ツールを使用して、削除するボーンを丸で囲みます。
次に、右クリックして[塗りつぶし]を選択し、不要なボーンをイメージからトリミングします。3D レンダリングからボーンボリュームを定量化するには、BoneJ プラグインを開いて[体積分率]を選択します。結果ウィンドウが表示され、骨量がミリメートルで立方体で表示されます。
3D レンダリングからボーンの長さを定量化するには、ImageJ マルチポイント ツールを使用します。3D レンダリングのイメージをキャプチャするには、[表示]をクリックしてスナップショットを作成します。次に、イメージを TIF または JPEG ファイルとして保存します。
これらの画像では、P3桁を再生する成体マウスの部分を、6日目から7日目、9日目、9日目、10日目の切断時に内経性骨再生および芽腫形成を視覚化する抗体で免疫染色した。ここでは、切断前にスキャンされた数字の代表的なマイクロCTレンダリングと、長さ測定値を識別するために使用されるランドマークを使用して再生の過程で様々な時点で示されています。マウスの数字モデルは遠位のレベルで切断されるときの芽腫形成を引き起こす前回生創傷環境を分析するための強力なシステムである。
逆に、数字の近位切断は、再生障害を調査するためのモデルシステムとして、また再生を強化するための試験戦略のためのサイトとして機能する。
