La amputación P3 es un modelo preclínico para investigar la regeneración epimórfica de los mamíferos y una poderosa herramienta para identificar poblaciones y mecanismos celulares críticos que controlan la regeneración endógena. El modelo P3 permite la identificación de poblaciones de células blastémicas tempranas y tardías, el estudio de la revascularización durante la regeneración y la investigación de la osificación intramembranosa sin requisitos complejos de dispositivos de estabilización ósea. Demostrando el procedimiento conmigo serán Osama Qureshi, Alyssa Falck, y Katherine Zimmel, técnica, y Regina Brunaeur, una profesora asistente de investigación, todas de nuestro laboratorio.
Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón CD-1 de ocho a 12 semanas de edad, Aplique ung ón en los ojos del animal y coloque el ratón debajo de un microscopio de disección 10X. Utilice yodo povidona quirúrgico y 70%etanol para esterilizar los dígitos de cada extremidad posterior y utilizar microscisores para recortar el cabello lejos del sitio quirúrgico. Aplicar un microlitro de bupivacaína tópica localmente para anestesiar el sitio quirúrgico, y suavemente tocar una pata trasera para exponer la superficie del dígito medial.
A continuación, sosteniendo el bisturí en un ángulo paralelo a la almohadilla de grasa, utilice un bisturí estéril número 10 para amputar la punta distal de la falange terminal de los dígitos dos y cuatro. Aplicar un microlitro adicional de bupivacaína localmente a cada dígito amputado y devolver el ratón a una jaula limpia para permitir que las heridas sanen sin vendaje de la herida y con monitoreo hasta la recumbencia completa. Para asegurar un plano de amputación P3 exitoso, sostenga el bisturí paralelo a la almohadilla de grasa durante la amputación y realice la exploración de micro-CT para confirmar la longitud de amputación correcta.
En el punto final experimental adecuado, utilice un bisturí para cortar el dígito a mitad de camino a través del hueso de la falange media aproximadamente en la segunda sangría de la almohadilla de grasa ventral. Transfiera el tejido a un vial de centelleo de 20 mililitros que contenga 10 mililitros de fijador de formalina de zinc con tamponado fresco durante 24 a 48 horas. Y utilizar un microtomo para adquirir secciones de cuatro a cinco micrómetros de espesor de cada dígito, colocando las rodajas en un baño de agua de 38 a 41 grados Celsius complementado con una solución adhesiva histológica a medida que se obtienen.
A continuación, capture las rodajas en las diapositivas adhesivas y coloque las diapositivas en un calentador de diapositivas Celsius de 37 grados para secar. Cuando los portaobjetos se hayan desparafinado, sumerja las muestras en un frasco de tinción de una solución de recuperación de antígeno adecuada, y caliente los portaobjetos a 95 grados centígrados durante 25 minutos asegurándose de que no se produzca la ebullición. Al final de la incubación, deje que el frasco llegue a temperatura ambiente, y poner los portaobjetos planos en una caja deslizante de plástico cubierta profunda de una pulgada con papel tisú humedecido en la base.
Añadir 100 microlitros de proteinasa precalentada K a cada muestra. Cubra cada diapositiva con una pequeña tira de parafilm para asegurarse de que las secciones no se sequen. Después de 12 minutos a 37 grados centígrados, retire cuidadosamente la película de parafina y drene suavemente las diapositivas en papel tisú para eliminar el exceso de solución de bloqueo.
A continuación, añada entre 100 y 200 microlitros de la solución primaria de anticuerpos de interés para cada diapositiva. Devolver los sitios a la cámara humidificadora cubierta con película de parafina para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, después de lavar los portaobjetos en solución salina tamponada TRIS, además de TWEEN o TBST, etiqueta los portaobjetos con una solución de anticuerpos secundaria adecuada para una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz.
Al final de la incubación, lave los portaobjetos en TBST y dérelos secar. A continuación, utilice 100 microlitros de medios de montaje anti-fade para colocar cuidadosamente los cubreobjetos en los portaobjetos secos y almacene los portaobjetos planos a temperatura ambiente durante la noche protegidos de la luz para permitir que el medio de montaje se seque. Para la tomografía microcalculada in vivo secuencial o micro-CT equipar el micro-CT imager con tubo para permitir el flujo de oxígeno dentro y fuera de la cámara animal micro-CT, asegurándose de que el oxígeno saliente está equipado con un filtro de carbón activado para atrapar el isoflurano.
Establezca el Voxelsize en 10,5 micrómetros en 55 kilovoltaje pico y 145 microamperios con 1.000 proyecciones por 180 grados y rotación continua con un tiempo de integración de 200 milisegundos, lo que resulta en un máximo de 213 cortes por escaneo. Cuando el escáner esté listo, coloque suavemente el ratón anestesiado en la cámara animal micro-CT con los dígitos de las extremidades posteriores dispuestos en el lado ventral plano y de estrecha asociación hacia arriba con la pata izquierda en el lado izquierdo y la derecha en el lado derecho de la plataforma de escaneo. A continuación, aplique cinta quirúrgica para fijar suavemente los dígitos en su lugar.
Aplique pomada oftálmica a los ojos del animal antes de iniciar la exploración. Después de escanear, regrese el animal a una jaula limpia con monitoreo hasta la recumbencia completa, y permita hasta varias horas para la reconstrucción de la imagen de micro-CT. Para el análisis de la imagen ósea 3D reconstruida, utilizando el software proporcionado con el micro-CT, convierta los archivos de imagen en una serie de archivos DICOM.
Cuando todos los archivos se hayan convertido, descargue la serie DICOM en una sola carpeta utilizando un descargador de archivos por lotes en un navegador web. Cargue el complemento BoneJ en la carpeta del complemento ImageJ. Arrastre y suelte la carpeta de la serie de archivos DICOM en la barra ImageJ para abrir los archivos.
Se abrirá una pila de imágenes de 16 bits que muestra todos los valores grises. Para mostrar solo el hueso, haga clic en Ajuste de imagen y Umbral. Deslice la barra de umbral superior hacia el extremo derecho y ajuste la barra de umbral inferior hasta que solo el hueso se resalte en rojo.
El valor de umbral inferior será de aproximadamente 10.000 a 13.000 a una intensidad máxima de la señal de 32.767. Haga clic en Aplicar y, en el nuevo cuadro de diálogo, haga clic en Fondo negro. A continuación, haga clic en Aceptar. Se generará una imagen de ocho bits que muestre valores en blanco y negro.
Con el blanco correspondiente al hueso. Dibuja un rectángulo alrededor del hueso P3 para seleccionarlo y duplicar la pila. Para generar una imagen 3D, haga clic en Plugins y Visor 3D y utilice la herramienta de selección a mano alzada para rodear el hueso que se va a eliminar.
A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione Rellenar selección para recortar cualquier hueso innecesario de la imagen. Para cuantificar el volumen óseo de la representación 3D, abra el complemento BoneJ y seleccione Fracción de volumen. Aparecerá una ventana de resultados y el volumen óseo mostrado en milímetros en cubos.
Para cuantificar la longitud ósea de la representación 3D, utilice la herramienta multipunto ImageJ. Para capturar una imagen de la representación 3D, haga clic en Ver y tome una instantánea. A continuación, guarde la imagen como un archivo TIF o JPEG.
En estas imágenes, las secciones de un dígito P3 regenerador de ratón adulto fueron inmunosuradas con anticuerpos para visualizar la regeneración ósea intramembranosa y la formación de blastema en los días seis a siete, nueve y 10 post-amputación. Aquí, se muestran representaciones representativas de micro-CT de dígitos escaneados antes de la amputación y en varios momentos a lo largo de la regeneración con puntos de referencia utilizados para identificar las mediciones de longitud. El modelo de dígitos del ratón es un potente sistema para analizar un entorno de herida pro-regenerativa que desencadena la formación de blastema cuando se amputa a un nivel distal.
Por el contrario, la amputación proximal de los dígitos sirve como un sistema modelo para investigar fallas regenerativas, así como un sitio para probar estrategias para mejorar la regeneración.
