P3 amputasyonu memeli epimorfik rejenerasyonunu araştırmak için bir preklinik model ve kritik hücre popülasyonlarını ve endojen rejenerasyonu kontrol eden mekanizmaları belirlemek için güçlü bir araçtır. P3 modeli erken ve geç blastemal hücre popülasyonlarının tanımlanmasına, rejenerasyon sırasında revaskülarizasyon çalışmasına ve kompleks kemik stabilizasyon cihazı gereksinimleri olmadan intramembranöz kemikleşmenin araştırılmasına olanak sağlar. Benimle prosedürü gösteren Usame Qureshi, Alyssa Falck ve Katherine Zimmel, teknisyen ve Regina Brunaeur, bir Araştırma Görevlisi Profesör tüm laboratuvardan olacaktır.
Sekiz ila 12 haftalık BIR CD-1 farede ayak parmak kıskacına yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, hayvanın gözlerine merhem uygulayın ve fareyi 10X diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Her arka ekstremitenin basamaklarını sterilize etmek için cerrahi povito iyot ve %70 etanol kullanın ve kılları cerrahi bölgeden uzaklaştırmak için mikrosksörü kullanın. Cerrahi siteyi anestezik için yerel topikal bupivacaine bir mikrolitre uygulayın ve yavaşça medial basamak yüzeyini ortaya çıkarmak için bir arka pençe splay.
Daha sonra neşteri yağ yastığına paralel bir açıda tutarak, iki ve dört basamaklı terminal falanksın distal ucunu kesecek steril bir sayı 10 neşter kullanın. Her amputated rakam yerel bupivacaine bir ek mikrolitre uygulayın ve yara pansuman olmadan ve tam recumbency kadar izleme ile yaraların iyileşmesini sağlamak için temiz bir kafes için fare dönmek. Başarılı bir P3 ampütasyon düzlemi sağlamak için, amputasyon sırasında yağ yastığına paralel neşter tutun ve doğru ampütasyon uzunluğunu doğrulamak için mikro-CT tarama yapın.
Uygun deneysel bitiş noktasında, yaklaşık ikinci ventral yağ yastığı girinti de orta falanks kemiği ile orta daki basamak kesmek için bir neşter kullanın. 24 ila 48 saat boyunca taze tamponlu çinko formalin fiksatif 10 mililitre içeren bir 20 mililitre sintillation şişe doku aktarın. Ve her basamaktan 4-5 mikrometre kalınlığında kesitler elde etmek için bir mikrotom kullanın, elde edildiklerinde histolojik yapışkan çözeltisi ile desteklenen 38 ila 41 derece lik bir su banyosuna dilimleri yerleştirin.
Ardından dilimleri yapışkan slaytlarda yakalayın ve slaytları kuruması için 37 derecelik santigrat kaydırak ısıtıcısına yerleştirin. Slaytlar deparafinize edildiğinde numuneleri uygun bir antijen alma çözeltisinin boyama kavanozuna batırın ve slaytları kaynamanın oluşmadığından emin olmak için 25 dakika boyunca 95 dereceye ısıtın. Kuluçka sonunda, kavanoz oda sıcaklığına gelmek için izin ve tabanında nemlendirilmiş doku kağıt ile bir inç derin kaplı plastik slayt kutusunda slaytlar düz yatıyordu.
Her numuneye 100 mikrolitre önceden ısınmış proteinaz K ekleyin. Bölümlerin kurumaması için her slaytı küçük bir parafilm şeridiile kaplayın. 37 santigrat derece 12 dakika sonra, dikkatle parafin film kaldırmak ve yavaşça fazla engelleme solüsyonu kaldırmak için doku kağıt üzerinde slaytlar drenaj.
Daha sonra, her slayt ilgi birincil antikor çözeltisi 100 ila 200 mikrolitre ekleyin. Dört santigrat derece bir gecede kuluçka için parafin film ile kaplı nemlendirici odasına siteleri dönün. Ertesi sabah TRIS-tamponlu tuzlu artı TWEEN veya TBST etiket slaytlar yıkandıktan sonra Oda sıcaklığında ışıktan korunan 45 dakikalık kuluçka için uygun bir ikincil antikor çözeltisi ile slaytlar.
Kuluçka sonunda, TBST slaytlar yıkayın ve onları kurumasını bekleyin. Daha sonra 100 mikrolitre anti-fade montaj ortamı nı kullanarak kapakları kurutulmuş kaydıraların üzerine dikkatlice yerleştirin ve kayaçları gece boyunca ışıktan korunan oda sıcaklığında düz bir şekilde saklayın ve montaj ortamının kurumasını bekleyin. Sıralı in vivo mikro-bilgisayarlı tomografi veya mikro-CT kıyafeti için mikro-CT görüntüleyici tüp ile mikro-CT görüntüleyici içine ve mikro-CT hayvan odası içine oksijen akışını sağlamak için, dışarı akan oksijen isoflurane tuzak için aktif bir kömür filtresi ile donatılmış olduğundan emin olun.
Voxelsize'ı 55 pik kilovoltajda 10,5 mikrometreye ve 180 derece başına 1.000 projeksiyonla 145 mikrometreye ve 200 milimetrelik entegrasyon süresiyle sürekli döndürmeye ayarlayarak tarayın başına en fazla 213 dilim elde edin. Tarayıcı hazır olduğunda, anestezili fareyi yavaşça mikro-CT hayvan odasına, arka ekstremite rakamları düz olarak düzenlenmiş, sol tarafta sol pençe ile yakın ilişkilendirme ventral tarafı ve tarama platformunun sağ tarafında sağ tarafta yerleştirin. Sonra yavaşça yerinde basamakları güvenli cerrahi bant uygulayın.
Taziyi başlatmadan önce hayvanın gözlerine oftalmik merhem uygulayın. Taradıktan sonra, hayvanı tam recumbency kadar izleme ile temiz bir kafese geri dönün ve mikro-CT görüntü rekonstrüksiyonu için birkaç saat kadar izin verin. Yeniden oluşturulan 3D kemik görüntüsünün analizi için, mikro-CT ile sağlanan yazılımı kullanarak, görüntü dosyalarını bir dizi DICOM dosyasına dönüştürün.
Tüm dosyalar dönüştürüldüğünde, dicom serisini bir web tarayıcısında toplu dosya indirici kullanarak tek bir klasöre indirin. BoneJ eklentisini ImageJ eklentisi klasörüne yükleyin. Dosyaları açmak için DICOM dosya serisi klasörünü ImageJ çubuğuna sürükleyip bırakın.
Tüm gri değerleri görüntüleyen 16 bitlik bir görüntü yığını açılır. Yalnızca kemik görüntülemek için Görüntü Ayarla ve Eşik'i tıklatın. Üst eşik çubuğunu en sağa kaydırın ve yalnızca kemik kırmızı vurgulanana kadar alt eşik çubuğunu ayarlayın.
Alt eşik değeri yaklaşık 10, 000 ila 13, 000 32, 767 maksimal sinyal yoğunluğu nda olacaktır. Uygula'yı tıklatın ve yeni iletişim kutusunda Siyah arka planı tıklatın. Ardından, Tamam'ı tıklatın. Siyah ve beyaz değerleri görüntüleyen sekiz bitlik bir görüntü oluşturulur.
Beyaz, kemiğe karşılık geliyor. Seçmek ve desteyi çoğaltmak için P3 kemiğinin etrafına bir dikdörtgen çizin. 3B görüntü oluşturmak için Eklentiler ve 3B Görüntüleyici'yi tıklatın ve silinecek kemiği daire içine almak için serbest seçim aracını kullanın.
Ardından sağ tıklayın ve görüntüden gereksiz kemik kırpmak için Seçim'i seçin. 3B işlemedeki kemik hacmini ölçmek için BoneJ eklentisini açın ve Hacim Fraksiyonu'nu seçin. Bir sonuç penceresi görünür ve kemik hacmi milimetre küp olarak görüntülenir.
3B işlemedeki kemik uzunluğunu ölçmek için ImageJ çok noktalı aracını kullanın. 3B işlemenin görüntüsünü yakalamak için Görüntüle'yi tıklatın ve anlık görüntü alın. Ardından görüntüyü TIF veya JPEG dosyası olarak kaydedin.
Bu görüntülerde P3 haneyenileyen yetişkin bir farenin bölümleri, amputasyon sonrası 6, 9 ve 10 pmasyon sonrası günde intramembranöz kemik rejenerasyonu ve blastema oluşumunu görselleştirmek için antikorlarla immünosentez yapıldı. Burada, amputasyon dan önce ve yenileme boyunca çeşitli zaman noktalarında taranmış basamakların temsili mikro-CT görüntüleri, uzunluk ölçümlerini tanımlamak için kullanılan işaretlerle gösterilir. Fare basamak modeli, distal düzeyde ampütasyonu tetikleyen projeneratif yara ortamını analiz etmek için güçlü bir sistemdir.
Tersine, basamak proksimal amputasyon rejeneratif başarısızlık araştırmak için bir model sistemi olarak hizmet yanı sıra rejenerasyon geliştirmek için stratejiler test etmek için bir site.
