Die P3-Amputation ist ein präklinisches Modell zur Untersuchung der epimorphen Regeneration von Säugetieren und ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung kritischer Zellpopulationen und Mechanismen zur Kontrolle der endogene Regeneration. Das P3-Modell ermöglicht die Identifizierung von frühen und späten blastemalen Zellpopulationen, die Untersuchung der Revaskularisation während der Regeneration und die Untersuchung der intramembranösen Verknöcherung ohne komplexe Anforderungen an Knochenstabilisierungsgeräte. Mit mir werden Osama Qureshi, Alyssa Falck und Katherine Zimmel, Technikerin, und Regina Brunaeur, eine wissenschaftliche Assistenzprofessorin aus unserem Labor, das Verfahren demonstrieren.
Nachdem Sie eine fehlende Reaktion auf Zehenkniff in einer acht bis 12 Wochen alten CD-1-Maus bestätigt haben, tragen Sie die Salbe auf die Augen des Tieres auf und legen Sie die Maus unter ein 10-faches Seziermikroskop. Verwenden Sie chirurgisches Povidon-Jod und 70%Ethanol, um die Ziffern jeder Hinterbeine zu sterilisieren und Mikroschere zu verwenden, um Haare von der chirurgischen Stelle weg zu trimmen. Tragen Sie einen Mikroliter topischen Bupivacaine lokal auf, um die chirurgische Stelle zu beäschden, und spielen Sie vorsichtig eine Hinterpfote, um die mediale ZifferOberfläche freizulegen.
Halten Sie dann das Skalpell in einem Winkel parallel zum Fettpolster, verwenden Sie eine sterile Zahl 10 Skalpell, um die distale Spitze der Terminalphalanx der Ziffern zwei und vier zu amputieren. Tragen Sie einen zusätzlichen Mikroliter Bupivacaine lokal auf jede amputierte Ziffer auf und geben Sie die Maus in einen sauberen Käfig zurück, damit die Wunden ohne Wundverband und mit Überwachung bis zur vollständigen Resumbenität heilen können. Um eine erfolgreiche P3-Amputationsebene zu gewährleisten, halten Sie das Skalpell während der Amputation parallel zum Fettpolster und führen Sie Mikro-CT-Scans durch, um die korrekte Amputationslänge zu bestätigen.
Verwenden Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt ein Skalpell, um die Ziffer in der Mitte des mittleren Phalanxknochens bei etwa dem zweiten ventralen Fettpolstereinzug zu trennen. Übertragen Sie das Gewebe in eine 20-Milliliter-Szintillationsflasche mit 10 Milliliter frisch gepuffertem Zinkformalin fixativ für 24 bis 48 Stunden. Und verwenden Sie ein Mikrotome, um vier bis fünf Mikrometer dicke Abschnitte jeder Ziffer zu erwerben, indem Sie die Scheiben in ein 38 bis 41 Grad Celsius Wasserbad legen, das mit einer histologischen Klebstofflösung ergänzt wird, wie sie erhalten werden.
Dann erfassen Sie die Scheiben auf Klebeschlitten und legen Sie die Dias auf einem 37-Grad-Celsius-Diawärmer zum Trocknen. Wenn die Dias deparaffinisiert wurden, tauchen Sie die Proben in ein Färbeglas einer geeigneten Antigen-Retrieval-Lösung ein und erhitzen Sie die Dias 25 Minuten lang auf 95 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass das Kochen nicht stattfindet. Lassen Sie das Glas am Ende der Inkubation auf Raumtemperatur kommen und legen Sie die Dias flach in eine ein Zoll tiefe, bedeckte Kunststoff-Diabox mit befeuchteten Tissuepapier an der Basis.
Fügen Sie 100 Mikroliter vorgewärmte Proteinase K zu jeder Probe hinzu. Bedecken Sie jede Folie mit einem kleinen Streifen Parafilm, um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht trocken werden. Nach 12 Minuten bei 37 Grad Celsius den Paraffinfilm vorsichtig entfernen und die Dias vorsichtig auf Tissuepapier abtropfen lassen, um eine überschüssige Blockierlösung zu entfernen.
Als Nächstes fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter der primären Antikörperlösung hinzu, die für jedes Dia von Interesse ist. Bringen Sie die Standorte in die mit Paraffinfolie bedeckte Befeuchtungskammer zurück, um eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius zu erhalten. Am nächsten Morgen nach dem Waschen der Dias in TRIS-gepufferter Kochnische plus TWEEN oder TBST beschriften Sie die Dias mit einer geeigneten Sekundärantikörperlösung für eine 45-minütige Inkubation bei lichtgeschützter Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubation die Dias in TBST waschen und trocknen lassen. Verwenden Sie dann 100 Mikroliter Anti-Fade-Montagemedium, um Die Deckel sorgfältig auf die getrockneten Dias zu legen und die Dias flach bei Raumtemperatur über Nacht vor Licht geschützt zu lagern, damit das Montagemedium trocknen kann. Für die sequenzielle In-vivo-Mikrocomputertomographie oder das Mikro-CT-Outfit wird der Micro-CT-Imager mit Schläuchen, um den Sauerstofffluss in und aus der Mikro-CT-Tierkammer zu ermöglichen, sichergestellt, dass der ausströmende Sauerstoff mit einem Aktivkohlefilter ausgestattet ist, um das Isofluran zu fangen.
Stellen Sie die Voxelsize auf 10,5 Mikrometer bei 55 Spitzen-Kilovoltund und 145 Mikroampere mit 1.000 Projektionen pro 180 Grad und kontinuierlicher Rotation mit einer Integrationszeit von 200 Millisekunden ein, was zu maximal 213 Slices pro Scan führt. Wenn der Scanner bereit ist, legen Sie die anästhesierte Maus vorsichtig in die Mikro-CT-Tierkammer mit den hinteren Gliedmaßenziffern, die in flachen, engen, venralen Seiten mit der linken Pfote auf der linken Seite und der rechten Seite auf der rechten Seite der Scanplattform angeordnet sind. Dann chirurgisches Klebeband auftragen, um die Ziffern vorsichtig an Ort und Stelle zu sichern.
Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen des Tieres auf, bevor Sie den Scan einleiten. Nach dem Scannen, kehren Sie das Tier in einen sauberen Käfig mit Überwachung bis zur vollständigen Rekonbergung zurück und lassen Sie bis zu mehreren Stunden für die Mikro-CT-Bildrekonstruktion. Zur Analyse des rekonstruierten 3D-Knochenbildes, mit der Software mit dem micro-CT, konvertieren Sie die Bilddateien in eine Reihe von DICOM-Dateien.
Wenn alle Dateien konvertiert wurden, laden Sie die DICOM-Serie in einem einzigen Ordner mit einem Batchdatei-Downloader in einem Webbrowser herunter. Laden Sie das BoneJ-Plug-In in den ImageJ-Plug-In-Ordner. Ziehen Sie den Ordner der DICOM-Dateiserie in die ImageJ-Leiste, um die Dateien zu öffnen.
Ein 16-Bit-Bildstapel, der alle Grauwerte anzeigt, wird geöffnet. Um nur Bone anzuzeigen, klicken Sie auf Bildanpassung und Schwellenwert. Schieben Sie den oberen Schwellenbalken nach ganz rechts, und passen Sie den unteren Schwellenwertbalken an, bis nur der Knochen rot hervorgehoben ist.
Der untere Schwellenwert wird etwa 10.000 bis 13.000 bei einer maximalen Signalintensität von 32, 767 betragen. Klicken Sie auf Übernehmen, und klicken Sie im neuen Dialogfeld auf Schwarzhintergrund. Klicken Sie als Nächstes auf OK. Es wird ein Acht-Bit-Bild mit Schwarzweißwerten generiert.
Mit dem Weiß, das dem Knochen entspricht. Zeichnen Sie ein Rechteck um den P3-Bone, um ihn auszuwählen und den Stapel zu duplizieren. Um ein 3D-Bild zu generieren, klicken Sie auf Plugins und 3D Viewer und verwenden Sie das Freihandauswahl-Tool, um den zu löschenden Knochen einzukreisen.
Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Auswahl ausfüllen aus, um unnötigen Bone aus dem Bild zuzuschneiden. Um das Knochenvolumen aus dem 3D-Rendering zu quantifizieren, öffnen Sie das BoneJ-Plug-In, und wählen Sie Volume Fraction aus. Ein Ergebnisfenster wird angezeigt und das Knochenvolumen in Millimetern gewürfelt.
Um die Knochenlänge aus dem 3D-Rendering zu quantifizieren, verwenden Sie das ImageJ-Multipoint-Werkzeug. Um ein Bild des 3D-Renderings zu erfassen, klicken Sie auf Anzeigen, und erstellen Sie einen Snapshot. Speichern Sie dann das Bild als TIF- oder JPEG-Datei.
In diesen Bildern wurden Abschnitte einer erwachsenen Maus regenerierenden P3-Ziffer mit Antikörpern immungefärbt, um die intramembranöse Knochenregeneration und Blastemabildung an Tag sechs bis sieben, neun und zehn nach der Amputation zu visualisieren. Hier werden repräsentative Mikro-CT-Renderings von Ziffern angezeigt, die vor der Amputation gescannt wurden, und zu verschiedenen Zeitpunkten im Laufe der Regeneration mit Landmarken, die zur Identifizierung von Längenmessungen verwendet werden. Das Mausziffernmodell ist ein leistungsfähiges System zur Analyse einer pro-regenerativen Wundumgebung, die Blastemabildung auslöst, wenn sie auf distaler Ebene amputiert wird.
Umgekehrt dient die proximale Amputation der Ziffern als Modellsystem zur Untersuchung von regenerativem Versagen sowie als Standort für Teststrategien zur Verbesserung der Regeneration.
