Ампутация P3 является доклинковой моделью для изучения эпиморфической регенерации млекопитающих и мощным инструментом для выявления критически важных популяций клеток и механизмов, которые контролируют эндогенную регенерацию. Модель P3 позволяет идентифицировать ранние и поздние популяции бластемальных клеток, изучение реваскуляризации во время регенерации, а также исследование внутримембранного околения без сложных требований к устройству стабилизации костей. Демонстрация процедуры со мной будет Усама Куреши, Алисса Фальк, и Кэтрин Зиммель, техник, и Регина Brunaeur, доцент-исследователь все из нашей лаборатории.
После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша в восемь-12-недельный CD-1 мыши, Нанесите мазь на глаза животного и поместите мышь под 10X микроскопом вскрытия. Используйте хирургический йод повидоне и 70% этанола для стерилизации цифр каждой задней конечности и использовать микросхемы для обрезки волос от хирургического участка. Нанесите один микролитер актуальных bupivacaine локально для анестезии хирургического сайта, и осторожно splay одну заднюю лапу, чтобы разоблачить медиальной поверхности цифры.
Затем, держа скальпель под углом, параллельным жировой прокладке, используйте стерильный скальпель номер 10, чтобы ампутировать дистальный кончик терминальной фаланги цифр два и четыре. Нанесите один дополнительный микролитер бупивакаина локально на каждую ампутированную цифру и верните мышь в чистую клетку, чтобы раны зажили без раневой повязки и с контролем до полного уценки. Чтобы обеспечить успешную плоскость ампутации P3, удерживайте скальпель параллельно жировой прокладке во время ампутации и выполняя микро-КТ сканирование, чтобы подтвердить правильную длину ампутации.
В соответствующей экспериментальной конечной точке используйте скальпель, чтобы разорвать цифру на полпути через среднюю фаланговую кость примерно на втором отступе брюшной жировой прокладки. Передача ткани в 20-миллилитровый сцинтилляционный флакон, содержащий 10 миллилитров свежей буферной фиксации формалина цинка в течение 24 до 48 часов. И использовать микротому, чтобы приобрести от четырех до пяти микрометров толщиной разделов каждой цифры, размещение ломтиков в 38 до 41 градусов по Цельсию водяной бани дополняется гистологическим клеевым раствором, как они получены.
Затем захватить ломтики на клеевых слайдов и место слайды на 37-градусный слайд по Цельсию теплее, чтобы высохнуть. Когда слайды были deparaffinized погрузить образцы в окрашивание банку соответствующего раствора поиска антигена, и тепло слайды до 95 градусов по Цельсию в течение 25 минут убедившись, что кипение не происходит. В конце инкубации, позвольте банку прийти к комнатной температуре, и заложить слайды плоские в один дюйм глубоко покрыты пластиковый слайд-бокс с увлажненной бумагой ткани у основания.
Добавьте в каждый образец 100 микролитров довоенной протеиназы K. Обложка каждого слайда с небольшой полосой парафильма, чтобы обеспечить разделы не становятся сухими. Через 12 минут при 37 градусах по Цельсию осторожно удалите парафиновую пленку и аккуратно слейте горки на бумаге, чтобы удалить избыток блокирующего раствора.
Затем добавьте к каждому слайду от 100 до 200 микролитров первичного раствора антител, представляющих интерес. Верните участки в увлажняющую камеру, покрытую парафиновой пленкой, для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро после мытья слайдов в TRIS-буферный солевой плюс TWEEN или TBST этикетки слайды с соответствующим вторичным раствором антител для 45-минутной инкубации при комнатной температуре защищены от света.
В конце инкубации промыть горки в TBST и дать им высохнуть. Затем используйте 100 микролитров анти-fade монтажа среды тщательно место coverslips на сушеные горки и хранить слайды плоские при комнатной температуре ночь защищены от света, чтобы монтаж среды сухой. Для последовательной микро-компьютерной томографии in vivo или микро-КТ оснащение микро-CT-изображения с трубкой, чтобы поток кислорода в и из микро-КТ животной камеры, убедившись, что отток кислорода оснащен активированным фильтром древесного угля, чтобы поймать изофлюран.
Установите Voxelsize до 10,5 микрометров на 55 пиковых килоэлектрограмм и 145 микроампер с 1000 проекций на 180 градусов и непрерывное вращение с интеграционным временем 200 миллисекунд, в результате чего максимум 213 ломтиков на сканирование. Когда сканер будет готов, аккуратно поместите анестезированной мыши в микро-КТ животной камеры с задними конечностями цифры расположены в плоской, тесной ассоциации брюшной стороне вверх с левой лапой на левой стороне и правой на правой стороне сканирующей платформы. Затем нанесите хирургическую ленту, чтобы мягко закрепить цифры на месте.
Нанесите офтальмологическую мазь на глаза животного перед началом сканирования. После сканирования, вернуть животное в чистую клетку с мониторингом до полной лежачих, и позволяют до нескольких часов для микро-КТ реконструкции изображения. Для анализа реконструированного 3D-изображения кости с помощью программного обеспечения, предоставляемого микро-CT, преобразуете файлы изображений в ряд файлов DICOM.
Когда все файлы были преобразованы, загрузите серию DICOM в одну папку с помощью загрузщика пакетных файлов в веб-браузере. Загрузите плагин BoneJ в папку плагина ImageJ. Перетащите папку серии файлов DICOM в бар ImageJ, чтобы открыть файлы.
Будет открыт 16-битный стек изображений, отображающий все серые значения. Чтобы отобразить только кость, нажмите На кнопку «Отрегулировать изображение» и «Порог». Сдвиньте верхнюю планку порога в крайнем правом направлении и отрегулируйте нижнюю планку порога до тех пор, пока только кость не будет выделена красным цветом.
Нижнее пороговое значение составит от 10 000 до 13 000 при максимальной интенсивности сигнала 32 767. Нажмите Применить и в новом диалоговом поле, нажмите Черный фон. Далее щелкните OK. Будет создано восьмибелое изображение, отображая черно-белые значения.
С белым, соответствующим кости. Нарисуйте прямоугольник вокруг кости P3, чтобы выбрать его и дублировать стек. Чтобы создать 3D-изображение, нажмите Plugins и 3D Viewer и используйте инструмент выбора от руки, чтобы обвести кость, чтобы быть удалены.
Затем нажмите правой кнопкой мыши и выберите выбор заполнения, чтобы обрезать любую ненужную кость из изображения. Для количественной оценки объема кости от 3D-рендеринга откройте плагин BoneJ и выберите фракцию объема. Появится окно результатов и объем кости отображается в миллиметрах куб.
Для количественной оценки длины кости от 3D-рендеринга используйте многоапунктный инструмент ImageJ. Чтобы запечатлеть изображение 3D-рендеринга, нажмите View и сделайте снимок. Затем сохраните изображение в виде файла TIF или JPEG.
На этих снимках разделы взрослой мыши, регенерирующей цифру P3, были иммунотелены антителами для визуализации внутримембранной регенерации костей и формирования бластемы в день 6-7, 9 и 10 после ампутации. Здесь показаны репрезентативные микроКТ-рендеры цифр, отсканированных до ампутации и в различные моменты времени в течение регенерации с ориентирами, используемыми для определения измерений длины. Модель мышиная цифра является мощной системой для анализа про-регенеративной среды раны, которая вызывает образование бластеремы при ампутации на дистального уровня.
И наоборот, проксимальная ампутация цифр служит модельной системой для расследования регенеративных сбоев, а также площадкой для тестирования стратегий повышения регенерации.
