هذه الطريقة تسهل توصيف فعال للأمراض المتعلقة أساليب كيناز RAF. هذه التقنية هي حساسة للغاية وقابلة للتكرار، فعالة من حيث التكلفة، وسهلة الاستعمال، ولا تتطلب أي معدات متقدمة. لقياس النشاط الحفاز من المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني، إدخال الطفرات التكنولوجيا العلم في تسلسل الترميز سلاح الجو الملكي البريطاني من قبل PCR، قبل إدراج تسلسل كامل في ناقلات المناسبة وفقا للبروتوكولات القياسية.
إدراج الجلوتاثيون كتسلسل الترميز transferase المنبع من تسلسل الترميز متحولة سلاح الجو الملكي البريطاني، لتوليد ناقلات ترميز الجلوتاثيون كما transferase تنصهر المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني، بنفس الطريقة. Transvect 80٪ إلى 90٪ التقاء 293T الثقافات الخلية مع ناقلات ترميز العلم الموسومة kinases سلاح الجو الملكي البريطاني أو المسوخ الخاصة بهم، وفقا لبروتوكولات المعايير. بعد 24 ساعة من الثقافة، استبدال الوسط في كل ثقافة.
بعد 48 ساعة من الثقافة، إضافة 400 ميكرولترات من عازلة تحلل تكملها مثبطات البروتياز والفوسفاتاز، إلى كل بئر على الجليد. بعد خمس إلى 10 دقائق نقل الخلية lysates إلى أنبوب 1.5 ملليلتر للطرد المركزي إلى رواسب حطام الخلية. نقل 300 ميكرولترات من كل عينة إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي صغيرة 1.5 ملليلتر.
جانبا 40 ميكرولترات لكل عينة للمصب الجملة lysate إشارة الخلوية اضافية ينظم كيناز واحد واثنين من التعبير والنشاط تحليل لطخة الأمينية. إضافة 20 ميكرولترات من الخرز تقارب المضادة لـ FLAG لكل أنبوب ، لمدة ساعة واحدة حضانة مع دوران في غرفة باردة أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة بسرعة وبلطف غسل الخرز العلم المضادة مرة واحدة مع عازلة تحلل في غرفة باردة ومواحدة من الوقت مع كيناز رد فعل العازلة قبل إضافة 20 ميكرولترات من خليط التفاعل كيناز.
قد يمسخون جرافة مع تقارب ديما منخفضة فقدان نشاطهم الحفاز في المختبر بسبب انفصال ديما. ولذلك، فإن غسل سريع ولطيف أمر بالغ الأهمية. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التقليب كل دقيقة، ووقف ردود فعل كيناز مع خمسة ميكرولترات من خمسة XSDS عينة العازلة، لكل عينة وغلي العينات في 90 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
في نهاية الحضانة، تشغيل العينات على 9 إلى 12٪ polyacrylamide هلام الكهرباء مع 0.1٪SDS، ثم نقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز للسماح الكشف عن مستويات بروتين الفوسفوجين المنشط كيناز وطفرات سلاح الجو الملكي البريطاني في كل عينة، عن طريق blotting المناعية. لتقييم النشاط Allosteric من المسوخ كيناز سلاح الجو الملكي البريطاني الميت، وبناء ناقلات ترميز المتلقي سلاح الجو الملكي البريطاني أو kinase dead RAF المنشطات. Transvect 293 T الخلايا مع اثنين من ناقلات ترميز كل من مستقبل سلاح الجو الملكي البريطاني وkinase الميتة RAF المنشط، أو ناقل واحد ترميز واحد من البروتينات كما هو موضح.
حصاد الخلية بأكملها lysates بعد 48 ساعة من الثقافة كما هو موضح، وخلط بسرعة الخلية كاملة نظيفة مع خمسة XSDS عينة العازلة في درجة حرارة الغرفة، قبل غليان ال ليسات لمدة خمس دقائق في 90 درجة مئوية. ثم تشغيل عينات الخلية الكاملة المسلوقة على هلام الكهرباء 9 إلى 12٪ بولياكريلاميد هذا 0.1٪SDS ونقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز للكشف عن مستويات إشارة الخلوية الزائدة فوسفو ينظم كيناز واحد واثنين والتحكم في البروتينات عن طريق النشاف المناعي كما هو موضح. لقياس التقارب خافت النسبية أو استقرار المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني بناء ناقلات ترميز ناقلات التكنولوجيا مشروع مشروع تنصهر إلى نهاية اليرا فيرفلي لوسيفراز أو C Terminus لوسيفايلاس اليراعات.
Transvect 293 T الخلايا مع زوج من ناقلات ترميز مختلفة و Terminus من المسوخ في مجال اليراعات في مجال الحرائق سلاح الجو الملكي البريطاني وC Terminus طفرات luciferase سلاح الجو الملكي البريطاني اليراعات اليراعات كما هو موضح. 24 ساعة بعد إعادة تخزين transvection مرتين 10 إلى الخامس 293 معاملات الخلية T في جيدا في لوحات صورة سوداء الكريستال في المتوسطة ملونة خالية. 48 ساعة بعد transvestion إضافة لوسيفرين إلى 293 T الخلايا transvectents واحتضان لمدة 30 دقيقة.
قبل قياس إشارات لوسيفراز على نظام الكشف المتعدد. في نهاية القياس pirate supernatents، وblice الخلايا T 293 التعامل مع lysas العازلة كما هو موضح. تشغيل كامل عينات الخلية lysate على 9 إلى 12٪ هلام الكهرباء 100000 1000 1000.
الكشف عن مستويات التعبير من نهاية نهاية نهاية endinus من المسوخ فيرفلي لوسيفراسي سلاح الجو الملكي البريطاني، أو المدى C من المسوخ فيرفلي لوسيفايساي من قبل مكافحة لطخة أمينية العلم كما هو موضح. ثم تطبيع إشارات لوسيفراز من 293 ت الخلايا transvectants وفقا لمستويات التعبير عن نهاية نهاية لوسيفيراز وE المدى من المسوخ فيرفلاي لوسيفراز سلاح الجو الملكي البريطاني. ويمكن استخدام كيناز في المختبر asa لتحقيق فعال في النشاط الحفاز لبعض المسوخ R-العمود الفقري النشطة بشكل تأسيسي، ولكن ليس ذلك من المسوخ كيناز الميت مع دمج C-العمود الفقري.
النشاط الحفاز من المسوخ RAF نشطة بشكل تأسيسي مع تقارب خافت ضعيف أو الاستقرار ومع ذلك، قد لا يكون التحقيق باستخدام هذا ASA كما يتم كسر الخافتات الخاصة بهم أثناء عملية تنقية. لتجنب فقدان النشاط الحفاز من المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني مع ضعف التقارب أو الاستقرار، يمكن أن تنصهر هذه المسوخ مع نقل الجلوتاثيون لإنقاذ النشاط الحفاز من المسوخ. يمكن استخدام سلاح الجو الملكي البريطاني المشترك تفعيل ASA لتقييم النشاط allosteric من كيناز الميت سلاح الجو الملكي المسوخ.
كما يتضح كيناز المسوخ الميتة مع عزر الطرفية الطرفية الحمضية والانصهار العمود الفقري C، وظيفة المنشطات الالويسترية لتحريك النشاط الحفاز من المسوخ مع غير الفوسفور الحمضية نهاية عزر الطرفية، عندما شارك أعرب في خلايا 293T. مزيد من انقسام مجاني luciferase SA يمكن استخدامها لقياس التقارب خافت النسبية أو الاستقرار من kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني والمسوخ بهم. استخدام عازلة lysas مع تركيز منخفض من المنظفات، وإجراء غسل لطيف سريع خلال تنقية العينة أمر ضروري لنجاح في المختبر كيناز SA. وستساعد هذه التقنية الباحثين على تحديد كيفية ترحيل المرض على وجه التحديد إلى المسوخ التابعة لسلاح الجو الملكي البريطاني، وتنشيط مسار المصب، وتسهيل اختيار الاستراتيجيات العلاجية المناسبة لعلاج الأمراض.
