Este método facilita la caracterización efectiva de los métodos de quinasa de la RAF relacionados con la enfermedad. Esta técnica es altamente sensible y reproducible, rentable, fácil de usar y no requiere ningún equipo avanzado. Para medir la actividad catalítica de los mutantes de la RAF, introduzca mutaciones tecnológicas de bandera en la secuencia de codificación de la RAF por PCR, antes de insertar secuencias enteras en el vector apropiado de acuerdo con los protocolos estándar.
Inserte el glutatión como secuencia de codificación transferasa aguas arriba de las secuencias de codificación mutantes de la RAF, para generar vectores que codifican glutatión como mutantes RAF fusionados con transferasa, de la misma manera. Transvect 80%to 90%confluent 293T cultivos celulares con los vectores que codifican la bandera etiquetada quinasas RAF o sus mutantes, de acuerdo con los protocolos de estándares. Después de 24 horas de cultivo, reemplace el medio en cada cultura.
Después de 48 horas de cultivo, añadir 400 microlitros de tampón de lelisis complementados con inhibidores de la proteasa y fosfatasa, a cada pozo en el hielo. Después de cinco a 10 minutos, transfiera los litos celulares a un tubo de 1,5 mililitros para centrifugación para sedimentar los desechos celulares. Transfiera 300 microlitros de cada muestra a tubos micro centrífugas individuales de 1,5 mililitros.
Reservar 40 microlitros por muestra para el análisis de la quinasa regulada por la señal celular extra de lisosato al por mayor aguas abajo una y dos análisis de la expresión y la actividad de la mancha. Añadir 20 microlitros de perlas de afinidad anti-FLAG a cada tubo, para una incubación de una hora con rotación en una sala fría de cuatro grados Celsius. Al final de la incubación lave rápidamente y suavemente las perlas anti bandera una vez con tampón de lelisis en la sala fría y una vez con tampón de reacción quinasa antes de añadir 20 microlitros de mezcla de reacción quinasa.
Los mutantes gráficos con una baja afinidad de Dima pueden perder su actividad catalítica in vitro debido a la disociación de Dima. Por lo tanto, el lavado rápido y suave es crítico. Después de 10 minutos a temperatura ambiente con voltear cada dos minutos, detenga las reacciones de quinasa con cinco microlitros de cinco tampones de muestra XSDS, por muestra y hierva las muestras a 90 grados centígrados durante cinco minutos.
Al final de la incubación, ejecute las muestras en un gel de electroforesis de poliacrilamida de nueve a 12% con 0,1%SDS, luego transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa para permitir la detección de los niveles de proteína quinasa activada por fosfogeno mitogenio y mutantes RAF en cada muestra, por inmunoinmunismo. Para evaluar la actividad alloestérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa, construye vectores que codifican el receptor de la RAF o los activadores de la RAF muertos de quinasa. Células T Transvect 293 con dos vectores que codifican tanto el receptor RAF como el activador RAF muerto de quinasa, o un solo vector que codifica una de las proteínas como se ha demostrado.
Cosecha toda la célula se lysates después de 48 horas de cultivo como se ha demostrado, y mezcle rápidamente el lesate limpio de toda la célula con cinco tampón de muestra XSDS a temperatura ambiente, Antes de hervir los lysates durante cinco minutos a 90 grados Celsius. A continuación, ejecute las muestras de anate de células enteras hervidas en un gel de electroforesis de poliacrilamida de nueve a 12%que es 0.1%SDS y transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa para detectar los niveles de fosfo señal celular extra regulada quinasa uno y dos y controlar las proteínas por hinchazón inmune como se ha demostrado. Para medir la afinidad relativa de los dimer y la estabilidad de los mutantes de la RAF construir vectores que codifican los mutantes de borrador de bandera fusionados con el terminal de Firefly luciferase o el C Terminus una luciferasa de luciélubán.
Células T Transvect 293 con un par de vectores que codifican diferentes y Terminus de mutantes de la RAF de luciosa de fuego y C Terminus un mutante de la RAF luciferasa luciosa de fuego como se demuestra. 24 horas después de la transvección replateación dos veces 10 a la quinta 293 transacciones de células T por pozo en placas de imagen de color negro cristalino. 48 horas después de la travesía añadir la luciferina a 293 transvectentes de células T e incubar durante 30 minutos.
Antes de medir las señales de luciferasa en un sistema de detección múltiple. Al final de la medición aspirar los sobrenadantes, y blice las transacciones de 293 células T con búfer de lysas como se demostró. Ejecuta las muestras de izado celular completo en un gel de electroforesis de poliacrilamida de nueve a 12% con 0,1%SDS.
Detectar los niveles de expresión de la terminal final de Firefly luciferase RAF mutantes, o la terminal C de Firefly luciferase RAF mutantes por anti bandera amino blot como se demostró. Luego normalizar las señales de luciferasa de los 293 transvectantes de células T de acuerdo con los niveles de expresión de la terminal final de Firefly luciferase y C terminus de firefly luciferase RAF mutantes. La quinasa asa in vitro se puede utilizar para sondear eficazmente la actividad catalítica de algunos mutantes de la espina dorsal R constitutivamente activos, pero no la de los mutantes muertos de quinasa con una espina C fusionada.
La actividad catalítica de mutantes de la RAF constitutivamente activos con una débil afinidad de dimer o estabilidad sin embargo, podría no ser sondeada usando este ASA ya que sus dimers se rompen durante el proceso de purificación. Para evitar la pérdida de actividad catalítica de los mutantes de la RAF con una débil afinidad o estabilidad dimer, estos mutantes se pueden fusionar con glutothionas transferase para rescatar la actividad catalítica de los mutantes. La activación conjunta de la RAF ASA se puede utilizar para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa.
Como los mutantes muertos de quinasa ilustrados con un motivo terminal extremo ácido y fusión de la columna vertebral C, funcionan como activadores alostéricos para desencadenar la actividad catalítica de los mutantes con un motivo terminal extremo ácido no fósforo relacionable, cuando se expresa co en células 293T. Además, se puede utilizar una luciferasa dividida gratuita SA para medir la afinidad relativa de dimer o la estabilidad de las quinasas familiares de la RAF y sus mutantes. El uso de un tampón de lysas con una baja concentración de detergente, y un procedimiento de lavado suave y rápido durante la purificación de la muestra es esencial para una SA quinasa in vitro exitosa. Esta técnica ayudará a los investigadores a determinar con precisión cómo la enfermedad transmite a los mutantes de la RAF, activar la vía descendente, facilitando la selección de estrategias terapéuticas adecuadas para el tratamiento de la enfermedad.
