Bu yöntem, hastalığa bağlı RAF kinaaz yöntemlerinin etkili karakterizasyonu kolaylaştırır. Bu teknik son derece hassas ve tekrarlanabilir, uygun maliyetli, kullanıcı dostu ve herhangi bir gelişmiş ekipman gerektirmez. RAF mutantlarının katalitik aktivitesini ölçmek için, standart protokollere göre uygun vektöre tüm dizileri eklemeden önce PCR tarafından RAF kodlama dizisine bayrak teknolojisi mutasyonları getirin.
Raf mutant kodlama dizilerinin transferaz kodlama dizisi olarak glutatyon ekleyin, transferaz erimiş RAF mutantlar olarak glutatyon kodlama vektörler oluşturmak için, aynı şekilde. Standart protokollerine göre RAF kinazlarını veya mutantlarını etiketledibayrağı kodlayan vektörlerle %80 ila %90'lık confluent 293T hücre kültürlerini transvect. Kültür 24 saat sonra, her kültürde orta değiştirin.
Kültür 48 saat sonra, proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenen lysis tampon 400 mikrolitre ekleyin, buz her kuyuya. 5-10 dakika sonra hücre enkaz ını tortulamak için santrifüj için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Her numunenin 300 mikrolitresini tek tek 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın.
Aşağı doğru toptan fosil ekstra hücresel sinyal düzenlenmiş kizaz bir ve iki ekspresyon ve aktivite amino leke analizi için örnek başına 40 mikrolitre ayırın. Her tüpe 20 mikrolitre anti-FLAG afinite boncuk ekleyin, dört derece santigrat soğuk odada rotasyon ile bir saatlik kuluçka için. Kuluçka sonunda hızlı ve yavaşça soğuk odada lysis tampon ve kizaz reaksiyon uğrama tampon ile bir kez kisaz reaksiyon karışımı 20 mikrolitre eklemeden önce anti bayrak boncuklar bir kez yıkayın.
Düşük Dima afinitesi olan Grafik Mutantlar Dima dissociation nedeniyle in vitro katalitik aktivite kaybedebilir. Bu nedenle, hızlı ve nazik yıkama önemlidir. Her dakika çevirme ile oda sıcaklığında 10 dakika sonra, örnek başına beş mikrolitre beş XSDS örnek tampon ile kizaz reaksiyonları durdurmak ve beş dakika boyunca 90 derece santigrat derecede örnekleri kaynatın.
Kuluçka sonunda, %0.1 SDS ile %9-12 poliakrilamid elektroforez jeli üzerinde numuneleri çalıştırın, sonra proteinleri nitroselüloz membrana aktararak her numunedeki fosfo mitojen-aktive protein kiazaz ve RAF mutantlarının seviyelerinin immün blotting ile algılanmasını sağlar. Kiaz ölü RAF mutantların Allosteric aktivitesini değerlendirmek için, RAF alıcı veya kiaz ölü RAF aktivatörleri kodlama vektörler inşa. Transvect 293 T hücreleri iki vektör ile hem RAF alıcı ve kinaz ölü RAF aktivatör, ya da tek bir vektör gösterildiği gibi proteinlerin birini kodlama kodlama kodlama.
Gösterildiği gibi 48 saatlik kültürden sonra tüm hücreli sıvıları hasat edin ve temiz hücre lisatını oda sıcaklığında beş XSDS numune tamponuyla hızlı bir şekilde karıştırın, lysates'i 90 derecede beş dakika kaynatmadan önce. Daha sonra haşlanmış tüm hücre lizat örneklerini %0,1 SDS olan 9-12% poliakrilamid elektroforez jeli üzerinde çalıştırın ve proteinleri nitroselüloz membrana aktarın. Göreceli dimer yakınlık ve RAF mutantların istikrarı ölçmek için firefly luciferase veya C Terminus bir ateş böceği luciferase terminus erimiş bayrak teknoloji taslak mutantlar kodlama vektörler inşa.
Transvect 293 T hücreleri vektörleri farklı ve Terminus firefly luciferase RAF mutantlar ve C Terminus bir firefly luciferase RAF mutantlar kodlayan bir çift gösterildiği gibi. Transveksiyon replate iki kez 10 sonra 24 saat 5 293 T hücre işlemleri iyi başına renk siz ortamda kristal siyah görüntü plakaları içine. Transvesyondan 48 saat sonra luciferini 293 T hücre travestilerine ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Çok algılama sistemindeluciferase sinyalleri ölçmeden önce. Ölçüm sonunda supernatents aspirate ve blice 293 T hücreleri lysas tampon ile gösterildiği gibi. Tüm hücre lizat örnekleri% 0.1 SDS ile 9-12% poliakrilamid elektroforez jel üzerinde çalıştırın.
Firefly luciferase RAF mutantların son terminus ifade düzeylerini algıla, ya da firefly luciferase RAF mutantların C terminus anti bayrak amino leke tarafından gösterildiği gibi. Daha sonra Firefly luciferase ve Firefly luciferase RAF mutantların C terminus son terminus ifade düzeylerine göre 293 T hücre transvectants luciferase sinyalleri normalleştirmek. In vitro kinasa asa etkili bazı kurucu olarak aktif R-omurga mutantların katalitik aktivitesini araştırmak için kullanılabilir, ama bir erimiş C-omurga ile kimyaz ölü mutantlar değil.
Ancak zayıf bir dimer yakınlık veya istikrar ile kurucu aktif RAF mutantların katalitik aktivitesi, onların dimers arıtma işlemi sırasında kırık olarak bu ASA kullanılarak probed olmayabilir. Zayıf dimer yakınlık veya istikrar ile RAF mutantların katalitik aktivite kaybını önlemek için, bu mutantlar mutantların katalitik aktivitesikurtarmak için glutothionas transferaz ile erimiş olabilir. RAF co-aktivasyon ASA kinaz ölü RAF Mutantlar allosteric aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir.
Asidik son terminal motifi ve C omurga füzyonu ile resimli kinaaz ölü mutantlar gibi, allosteric aktivatörler olarak non fosfor göreceli asidik uç terminal motifi ile mutantların katalitik aktivitesini tetiklemek için işlev, co 293T hücreleri ifade zaman. Ayrıca ücretsiz bir bölünmüş luciferase SA göreceli dimer yakınlık veya RAF aile kinazları ve mutantların istikrarı ölçmek için kullanılabilir. Düşük oranda deterjan içeren lysas tamponu kullanmak ve numune saflaştırması sırasında hızlı bir yıkama işlemi, başarılı bir in vitro kinaaz SA için gereklidir. Bu teknik araştırmacılar ın, hastalığın RAF mutantlarını nasıl ileteceğini tam olarak belirlemelerine, aşağı akım yolunu etkinleştirmelerine ve hastalık tedavisi için uygun tedavi stratejilerinin seçilmesini kolaylaştırmalarına yardımcı olacaktır.
