Diese Methode erleichtert die effektive Charakterisierung von krankheitsbedingten RAF-Kinase-Methoden. Diese Technik ist hochsensibel und reproduzierbar, kostengünstig, benutzerfreundlich und erfordert keine fortschrittliche Ausrüstung. Um die katalytische Aktivität von RAF-Mutanten zu messen, führen Sie Flag-Tech-Mutationen per PCR in die RAF-Codierungssequenz ein, bevor Sie ganze Sequenzen gemäß Standardprotokollen in den entsprechenden Vektor einfügen.
Fügen Sie das Glutathion als Transferase-Codierungssequenz vor den RAF-Mutanten-Codierungssequenzen ein, um Vektoren zu erzeugen, die Glutathion als Transferase verschmolzene RAF-Mutationen kodieren, auf die gleiche Weise. Transvect 80% bis 90%konfluente 293T Zellkulturen mit den Vektoren, die die Flagge mit RAF-Kiinasen oder deren Mutanten kennzeichnen, gemäß Standardprotokollen. Nach 24 Stunden Kultur, ersetzen Sie das Medium in jeder Kultur.
Nach 48 Stunden Kultur, fügen Sie 400 Mikroliter LysePuffer mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren ergänzt, zu jedem Brunnen auf Eis. Nach fünf bis zehn Minuten übertragen Sie die Zelle lysiert in ein 1,5-Milliliter-Rohr zur Zentrifugation, um die Zellablagerungen zu sedimentieren. Übertragen Sie 300 Mikroliter jeder Probe in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren.
Legen Sie 40 Mikroliter pro Probe für die nachgeschaltete Großhandelslysat-fossile extrazelluläre Signal regulierte Kinase ein und zwei Expression und Aktivität Amino-Blot-Analyse beiseite. Fügen Sie 20 Mikroliter Anti-FLAG Affinität Sperlen zu jeder Röhre, für eine Stunde Inkubation mit Rotation in einem vier Grad Celsius kalten Raum. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Anti-Flag-Perlen schnell und vorsichtig einmal mit Lysepuffer im Kühlraum und einmal mit Kinase-Reaktionspuffer, bevor sie 20 Mikroliter Kinase-Reaktionsmischung hinzufügen.
GraphMutanten mit einer niedrigen Dima-Affinität können ihre katalytische Aktivität in vitro aufgrund der Dima-Dissoziation verlieren. Daher ist die schnelle und schonende Wäsche entscheidend. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Kippen jede zweite Minute, stoppen Sie die Kinase-Reaktionen mit fünf Mikrolitern von fünf XSDS-Probenpuffer, pro Probe und kochen Sie die Proben bei 90 Grad Celsius für fünf Minuten.
Führen Sie am Ende der Inkubation die Proben auf einem neun bis 12% Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel mit 0,1%SDS durch, und übertragen Sie die Proteine dann auf eine Nitrozellulosemembran, um den Nachweis der Konzentrationen von Phosphomitogen-aktivierter Proteinkinase und RAF-Mutanten in jeder Probe durch Immunblotting zu ermöglichen. Um die allosterische Aktivität von kinase toten RAF-Mutanten zu bewerten, konstruieren Sie Vektoren, die den RAF-Empfänger oder die Kinase-toten RAF-Aktivatoren kodieren. Transvect 293 T-Zellen mit zwei Vektoren, die sowohl den RAF-Empfänger als auch den kinasetoten RAF-Aktivator kodieren, oder einem einzelnen Vektor, der eines der Proteine kodiert, wie gezeigt.
Ernten Sie die ganze Zelle lysiert nach 48 Stunden Kultur, wie gezeigt, und mischen Sie schnell die saubere ganze Zelle Lysat mit fünf XSDS Probenpuffer bei Raumtemperatur, Vor dem Kochen der Lysate für fünf Minuten bei 90 Grad Celsius. Führen Sie dann die gekochten Ganzzelllysatproben auf einem neun bis 12% Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel, das 0,1%SDS ist, und übertragen Sie die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran, um die Phospho-Extrazellsignal-regulierten Kinase eins und zwei zu erkennen und Proteine durch Immunfleckung zu kontrollieren, wie gezeigt. Um die relative Dimer-Affinität und oder Stabilität der RAF-Mutanten zu messen, konstruieren Vektoren, die Flaggen-Tech-Entwurfsmutanten kodieren, die mit dem Endpunkt der Firefly-Luziferase oder dem C-Terminus eine Glühwürmchen-Luziferase verschmolzen sind.
Transvect 293 T-Zellen mit einem Paar von Vektoren, die verschiedene und Terminus der Galleife raf Mutanten und C Terminus eine Galle Luziferase RAF Mutanten wie gezeigt. 24 Stunden nach der Transvection Replate zweimal 10 bis die fünfte 293 T-Zelle Transaktionen pro gut in kristallschwarze Bildplatten in farbfreiem Medium. 48 Stunden nach der Transvestion das Luziferin zu 293 T Zelltransvectents geben und 30 Minuten inkubieren.
Vor der Messung der Luziferase-Signale auf einem Multi-Detektionssystem. Am Ende der Messung aspirieren die Überstände und bliten die transhandelten 293 T-Zellen mit Lysaspuffer, wie gezeigt. Führen Sie die gesamten Zelllysatproben auf einem 9 bis 12%polyacrylamidelektrophorese Gel mit 0,1%SDS aus.
Erkennen Sie die Expressionsstufen des Endendus von Firefly luciferase RAF Mutanten, oder die C-Endstation von Firefly luziferase RAF Mutanten durch Anti-Flagge-Amino-Blot, wie gezeigt. Dann normalisieren Sie die luziferase Signale der 293 T Zelltransvectante nach den Expressionsstufen der Endstation von Firefly luciferase und C Endstation von Firefly luciferase RAF Mutanten. Die In-vitro-Kinase asa kann verwendet werden, um die katalytische Aktivität einiger konstitutiv aktiver R-Spine-Mutationen effektiv zu untersuchen, nicht jedoch die von Kinase-toten Mutanten mit einer geschmolzenen C-Spinne.
Die katalytische Aktivität konstitutiv aktiver RAF-Mutationen mit einer schwachen Dimer-Affinität oder Stabilität kann jedoch nicht mit dieser ASA untersucht werden, da ihre Dimer während des Reinigungsprozesses gebrochen werden. Um den Verlust der katalytischen Aktivität von RAF-Mutanten mit schwacher Dimer-Affinität oder Stabilität zu vermeiden, können diese Mutanten mit Glutothionas Transferase verschmolzen werden, um die katalytische Aktivität der Mutanten zu retten. Die RAF-Koaktivierung ASA kann verwendet werden, um die allosterische Aktivität von Kinase-toten RAF-Mutanten zu bewerten.
Als illustrierte Kinase tot Mutanten mit einem sauren End-Terminal-Motiv und C-Rückenfusion, funktionieren als allosterische Aktivatoren, um die katalytische Aktivität von Mutanten mit einem nicht phosphorversäulichen sauren End-Terminal-Motiv auszulösen, wenn es in 293T-Zellen koausgedrückt wird. Darüber hinaus kann eine kostenlose Split-Luziferase-SA zur Messung der relativen Dimer-Affinität oder Stabilität von KI-Familienkinasen und deren Mutanten verwendet werden. Die Verwendung eines Lysaspuffers mit einer geringen Waschmittelkonzentration und eines schnellen sanften Waschvorgangs während der Probenreinigung ist für eine erfolgreiche In-vitro-Kinase SA unerlässlich. Diese Technik wird den Forschern helfen, genau zu bestimmen, wie Krankheit die RAF-Mutanten weiterleitet, den nachgeschalteten Weg zu aktivieren und die Auswahl geeigneter therapeutischer Strategien für die Krankheitsbehandlung zu erleichtern.
