이 방법은 질병 관련 RAF 키나아제 방법의 효과적인 특성화를 용이하게 한다. 이 기술은 매우 민감하고 재현 가능하며 비용 효율적이며 사용자 친화적이며 고급 장비가 필요하지 않습니다. RAF 돌연변이의 촉매 활성을 측정하려면 표준 프로토콜에 따라 전체 서열을 적절한 벡터에 삽입하기 전에 PCR에 의해 RAF 코딩 서열에 플래그 기술 돌연변이를 삽입합니다.
글루타티온을 RAF 돌연변이 코딩 시퀀스의 트랜스퍼라제 코딩 시퀀스 업스트림으로 삽입하여 글루타티온을 트랜스포마이즈 융합 RAF 돌연변이체로 인코딩하는 벡터를 동일한 방식으로 생성한다. 표준 프로토콜에 따라 표태그가 지정된 RAF 키나아제 또는 돌연변이를 코딩하는 벡터를 가진 80%에서 90%의 컨런트 293T 세포 배양을 변환합니다. 24 시간의 문화 후 각 문화에서 매체를 교체하십시오.
48시간의 배양 후, 프로테아제와 인산염 억제제로 보충된 400마이크로리터의 용액을 얼음 위에 잘 넣습니다. 5-10분 후에 세포는 세포 잔해를 퇴적시키기 위해 원심분리를 위해 1.5 밀리리터 튜브로 용해됩니다. 각 샘플의 300마이크로리터를 개별 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기습니다.
다운스트림 도매 용액 화석 추가 세포 신호 조절 키나아제 1 및 2 발현 및 활성 아미노 블롯 분석을 위한 샘플 당 40 마이크로리터를 따로 설정합니다. 각 튜브에 안티 플래그 친화성 구슬 20 마이크로 리터를 추가하여 섭씨 4도의 차가운 방에서 회전하여 1 시간 동안 인큐베이션을 합니다. 인큐베이션의 끝에서 는 차가운 방에 리시스 버퍼로 한 번, 키나제 반응 버퍼로 한 번 안티 플래그 구슬을 재빨리 세척한 후 키나아제 반응 혼합물의 20 마이크로리터를 첨가한다.
디마 선호도가 낮은 그래프 돌연변이는 디마 해리때문에 체외에서 촉매 활성을 잃을 수 있습니다. 따라서 빠르고 부드러운 세척이 중요합니다. 실온에서 10분 동안 다른 분마다 뒤집힌 후, 샘플당 5개의 XSDS 샘플 버퍼로 키나아제 반응을 멈추고 샘플을 섭씨 90도에서 5분간 끓입니다.
인큐베이션의 끝에서, 0.1%SDS를 가진 9-12%의 폴리아크릴아미드 전기포고이젤에 견본을 실행한 다음, 면역 분비질에 의하여 각 견본에 있는 인산 미토겐 활성화한 단백질 키나아제 및 RAF 돌연변이의 수준을 검출할 수 있도록 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 전송합니다. 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스터 활성을 평가하기 위해 RAF 수신기 또는 키나아제 죽은 RAF 활성제를 인코딩하는 벡터를 구성합니다. 2개의 벡터를 가진 트랜스Ct 293 T 세포는 RAF 수신기와 키나아제 죽은 RAF 활성제, 또는 단일 벡터를 코딩하는 것으로 입증된 바와 같이 단백질 중 하나를 인코딩하였다.
전체 셀용액을 48시간 동안 수확한 후, 깨끗한 전체 셀 용액을 실온에서 5개의 XSDS 샘플 버퍼와 빠르게 혼합한 후, 90°C에서 5분간 용재를 끓입니다. 그런 다음 삶은 전체 세포 용해 시료를 9~12%의 폴리아크릴아미드 전기포고이스 젤로 실행하고 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이송하여 인엑스트라 세포 신호 조절 키나아제 1및 2의 수준을 검출하고 면역 블로팅에 의한 단백질을 조절한다. RAF 돌연변이의 상대적 이머 친화성 및 또는 안정성을 측정하기 위해 반딧불 루시파라제 또는 C 터미누스 반딧불 루시파라제의 종족에 융합된 플래그 기술 드래프트 돌연변이를 인코딩하는 벡터를 구성한다.
반딧불 루시파제 RAF 돌연변이체와 C 터미누스의 상이하고 종신을 코딩하는 벡터 쌍의 293 T 세포를 반딧불 루시파제 RAF 돌연변이체. 트랜스프션 후 24시간 10~5차 293T 셀 트랜잭션을 잘 하여 색이 없는 매체의 크리스탈 블랙 이미지 플레이트로 한다. 복장 도착 후 48 시간 293 T 세포 경배분에 루시퍼린을 추가하고 30 분 동안 배양합니다.
복수 검출 시스템에서 루시파아제 신호를 측정하기 전에. 측정의 끝에서 슈퍼 네티텐트를 흡인하고, 입증 된 대로 리사 버퍼와 거래 된 293 T 셀을 블리빙. 전체 세포 용액 샘플을 9~ 12% 폴리아크릴아미드 전기포레시스 젤에 0.1%SDS로 실행합니다.
반딧불이 루시파라제 RAF 돌연변이의 종말 종단의 발현 수준을 감지하거나, 반딧불 루시파라기 RAF 돌연변이의 C 종점은 입증된 바와 같이 안티 플래그 아미노 블롯에 의한 반딧불 루시파라기 RAF 돌연변이의 종자. 그런 다음 반딧불 루시파라제와 반딧불 루시파라제 RAF 돌연변이체의 C 종단의 발현 수준에 따라 293 T 세포 경피제의 루시파래아제 신호를 정규화한다. 체외 키나아제 아사는 일부 구성 활성 R-척추 돌연변이체의 촉매 활성을 효과적으로 조사하는 데 사용할 수 있지만, 융합된 C-척추를 가진 키나아제 죽은 돌연변이의 활성은 그렇지 않습니다.
그러나 약한 이질친 친화성 또는 안정성을 가진 구성 활성 RAF 돌연변이체의 촉매 활성은, 정화 과정에서 그들의 희미한 자가 파손되기 때문에 이 ASA를 사용하여 조사되지 않을 수 있다. 약한 이질친 친화성 또는 안정성을 가진 RAF 돌연변이의 촉매 활성의 손실을 피하기 위해, 이러한 돌연변이는 돌연변이의 촉매 활성을 구출하기 위해 글루토티오나 트랜스포아제와 융합될 수 있다. RAF 공동 활성화 ASA는 키나아제 죽은 RAF 돌연변이의 알로스터 활성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
산성 말단 모티프 및 C 척추 융합을 가진 키나아제 죽은 돌연변이체와 같이, 알로스테릭 활성제로서 기능하여 293T 세포에서 공동 발현될 때 비 인광체 절제성 산성 말단 모티브를 가진 돌연변이체의 촉매 활성을 유발한다. 또한 무료 분할 루시파라제 SA는 RAF 가족 키나아제 및 돌연변이의 상대적인 이머 친화성 또는 안정성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 세제의 농도가 낮은 리사 버퍼를 사용하고, 시료 정제 시 빠른 부드러운 세척 절차는 시험관내 키나아제 SA에 필수적이다. 이 기술은 연구원이 질병이 RAF 돌연변이를 중계하고, 다운스트림 통로를 활성화하고, 질병 처리를 위한 적당한 치료 전략의 선택을 촉진하는 방법을 정확하게 결정하는 것을 도울 것입니다.
