الهدف العام لهذا الإجراء هو إثبات تطور الخلايا العصبية من فرس النهر والخلايا العصبية القشرية الأولية المختلطة المعزولة من جنين الفئران E14-E16 Sprague Doley ، من أجل تقديم منصة قوية ومنخفضة التكلفة لدراسة تأثير مختلف خيوط العلاج العصبي. كما تعلمون، أن الدماغ هو شبكة معقدة من الخلايا العصبية المرتبطة بعدد كبير من الخلايا الداعمة. لفهم وظيفة الدماغ، وغالبا ما يتم إعادة بدء معظم البحوث من التجارب في المختبر، والتي تنطوي على خطوط الخلايا المشتقة من النسب العصبي المتاحة تجاريا.
ومع ذلك، يتم تحويل خطوط الخلية هذه خطوط الخلايا التي تعاني من الاختلافات genotypic وphenotypic. لمعالجة هذه القضايا، وثقافة الخلايا العصبية الأولية هو النهج المناسب. هنا، أوضحنا بروتوكول بسيط وفعال من حيث التكلفة لثقافة الخلايا العصبية الأولية وبنينا منصة فحص قوية لمختلف العلاجات العصبية.
الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه فقط عن طريق تحوير كثافات طلاء الخلايا، يمكننا عرض اثنين من منصات ثقافة الخلايا العصبية المتناقضة حيث يؤدي انخفاض الكثافة إلى ثقافة الخلايا العصبية الأولية لفترات طويلة، وتولد عالية الكثافة الخلايا العصبية العفوية. خذ 24-صحن جيدا. واحدة للكثافة العالية، وأخرى للطلاء منخفض الكثافة.
نقل 12 مم من أغطية الزجاج المعقمة في لوحات 24-جيدا. صب 300 ميكرولترات من محلول PDL في كل من الآبار بطريقة تغطي بالكامل سطح الغطاء بأكمله. تحضير محلول PDL بتركيز 0.1 ملغ/مل في المياه الأيونية.
لف الألواح مع رقائق الألومنيوم لمنع التجفيف، والاحتفاظ بها في حاضنة CO2 بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قبل الطلاء، الطامح حل PDL. يُغسل بشكل صحيح بالماء المعقم لمدة مرتين إلى ثلاث مرات.
ثم إضافة وسائل الاعلام الطلاء، والعودة لوحات إلى الحاضنة حتى الطلاء. التضحية A14-E16 توقيت الحوامل Sprague-Dawley الفئران, جعل قطع على شكل حرف V في منطقة البطن باستخدام ملقط العقيمة وزوج من مقص نهاية حادة. إزالة جميع الأجنة ووضعها بعناية على لوحة بتري مع حل HBSS الباردة.
أخرج الأجنة من الـ"الاحتياز الجنيني" واغسلها بعناية في طبق بتري منفصل في هجنس طازج وبارد. قطع رأس مع مساعدة من مقص معقمة. نقل رؤساء في لوحات معقمة 90 مم بتري مع HBSS الباردة.
تحت المجهر ستيريو، عقد الرأس من منطقة خطم مع ملقط مسننة معقمة، والخروج من الدماغ عن طريق قطع الجلد والجمجمة مفتوحة. إزالة جميع السحايات من نصفي الكرة الأرضية و midbrain من خلال عقد جذع الدماغ. إزالة بعناية نصفي الكرة الأرضية سليمة، تشبه قبعات الفطر الذي يحتوي على قرن آمون والقشرة.
جمع نصفي الكرة الأرضية التي تحتوي على القشرة والحصون سليمة في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام الانفصام. السماح للأنسجة التي تم جمعها ليستقر، ويتبخر وسيط تفكك، وترك خمسة إلى عشرة في المئة من المتوسطة في ذلك. مرة أخرى، إضافة 10 مل من فصاية جديدة إلى ذلك، وتكرار هذه الخطوة مرتين.
إضافة 4.5 مل من منتصف التفكك و 0.5 مل من محلول التربسين-EDTA. يبقيه في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لعملية الهضم للمضي قدما. التعرق المتوسطة وغسل مع 10 مل من تفكك المتوسطة والطلاء المتوسطة، على التوالي.
resuspend لهم في 2.5 مل من وسط الطلاء. حافظ على طبق معقمة 90 مم فوق الغطاء المقلوب للطبق واسكبه في قاعدة طبق معقمة مقاس 90 مم. تثليت الأنسجة المهضوجة في قاعدة الزاوية من الطبق، وذلك باستخدام 1000 طرف ماصة ميكرولتر، وذلك لاحتلال أقل حجم.
تمرير تعليق الخلايا التي تم الحصول عليها من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر، باستثناء أي قطع من الأنسجة. تحديد كثافة الخلايا القابلة للحياة باستخدام استبعاد الصبغة الزرقاء trypan، وعد عدد الخلايا في عداد الخلايا الآلي. تخفيف عدد الخلايا التي تم الحصول عليها بطريقة بحيث لوحة 1.5 في 10 إلى قوة 5 خلايا لكل مل للطلاء عالية الكثافة، و 20،000 خلية لكل مل للطلاء منخفضة الكثافة في أنبوبين منفصلين تحتوي على 30 مل من المتوسط الطلاء.
التعرق وأضاف سابقا طلاء المتوسطة وطبقة 500 ميكرولترات من الخلايا المنتشرة في وسط الطلاء في كل بئر. بعد ذلك، إعادة لوحات إلى الحاضنة لمدة أربع ساعات. بعد أربع ساعات من الطلاء، فحص الخلايا للتمسك تحت المجهر.
بعد أربع ساعات من الطلاء، في كل من لوحات عالية ومنخفضة الكثافة، وتظهر الخلايا العصبية الالتزام جيدة لوحات. استبدل الوسط في كل بئر بـ 500 ميكرولترات من وسط الصيانة الطازجة، وحضنها في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. علينا أن نزرع هذه الخلايا العصبية المطلية لها في الكثافة العالية والمنخفضة.
في حين أن الخلايا العصبية مطلي منخفضة الكثافة يمكن استخدامها للثقافات لفترات طويلة، تصل إلى 30 يوما، عن طريق تغيير متوسط الصيانة مرتين في الأسبوع، والخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة يبدأ لتوليد تلقائيا neurospheres، والتي جاءت بعد يوم من الحفاظ على في لوحة منخفضة جدا. بعد 24 ساعة من الطلاء ، لوحظ أن كلا من الخلايا العصبية ذات الكثافة العالية والمنخفضة مطلي لعرض مورفولوجيا صحية. يتم عرض صورة على النقيض من المرحلة من الخلايا العصبية مطلي منخفضة الكثافة، المستزرعة لمدة سبعة أيام تقريبا، هنا.
الخلايا العصبية عرض مورفولوجيا صحية، ويمكن الحفاظ على ما يصل إلى 30 يوما مع توجيه أكثر قوة والترابط. الرسم البياني شريط هنا يظهر حوالي 90 في المئة جدوى الخلايا العصبية مطلي منخفضة الكثافة حتى بعد 30 يوما من الثقافة، كما يحددها مقايسة MTT. وقد تميزت الخلايا العصبية الأولية هنا من خلال المناعة مع تو 1، علامة على الخلايا العصبية المتباينة، وتاو، علامة على المحاور العصبية.
يتم تأكيد نقاء الخلايا العصبية من خلال عدم وجود تلطيخ في علامات غير الخلايا العصبية GFAP للسيبات الفلكية و O4 ل oligodendrocytes. في جميع دراسات التوصيف، وقد لطخت النوى مع Hoechst 33258. هنا ، تم لطخ الخلايا المصنفة منخفضة الكثافة بعلامة GFAP الفلكية وعلامة الخلايا العصبية Tuj 1 للتحقق من نقاء الثقافة حتى سبعة أيام.
ويلاحظ أن هذا البروتوكول يدعم النمو التفضيلي للخلايا العصبية على الخلايا الفلكية كما هو مبين من خلال التحليل الكمي. وقد لطخت Nuclei مع Hoechst 33258. وبالمثل ، في الخلايا المصنفة عالية الكثافة ، وقد لطخت الخلايا الفلكية مع GFAP والخلايا العصبية من قبل Tuj 1.
هنا، في التحليل الكمي، لوحظ حوالي 17 في المئة من الخلايا الفلكية بالمقارنة مع 83 في المئة من الخلايا العصبية. وقد لطخت نوى مع Hoechst 33258. بعد سبعة أيام ، يتم ملاحظة عدة خلايا عصبية تشكلت بشكل عفوي في الخلايا العصبية عالية الكثافة.
حول اليوم الثامن إلى العاشر من الثقافة، في الخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة، يبدأ الخلايا العصبية لتشكيل الإسقاطات الكبيرة والجسور التي تتكون من امتدادات تشبه الزبقية شعاعي. تشير الأسهم السوداء إلى الجسر بين اثنين من الاعصاب المشكلة حديثا. تم إجراء فحص الخلايا الحية والميتة على الخلايا العصبية لمدة 15 يومًا.
في كثيفة صبغ الكالسين AM، مع أي أي بوديد البروديوم على الإطلاق تلطيخ، يشير إلى ما يقرب من 100 في المئة صلاحية من neurospheres في الثقافة. يشير الرسم البياني الخطي هنا إلى توسع في حجم الـ neurospheres مع مرور عدد الأيام. هذه الصورة الملطخة بشكل مفرط من الغلاف العصبي يشير إلى عدد كبير من الخلايا السلف العصبي من خلال زيادة التعبير عن علامات NPC نستين و Tuj 1.
تظهر الخلايا العصبية هنا كميات عالية من الخلايا الفلكية التي تميزت بالتعبير القوي عن GFAP ، مصحوبة بتعبير أعلى من علامة الخلايا العصبية Tuj 1. وقد لطخت نوى مع Hoechst 33258. لذلك أعتقد أن بروتوكولنا مثير ومثير للاهتمام، بالنظر إلى حقيقة أنه من خلال استراتيجية واحدة، يمكننا الحصول على منصتين: واحدة 2-D و 3-D.
وهذا سيكون منصة كبيرة لفحص المسارات العلاجية العصبية المختلفة. لذا أعتقد أنه مفيد حقاً لجميع علماء الأعصاب. أيضا جانب آخر مهم هو أن neurospheres نختار في غنية للغاية في الخلايا السلف العصبية، وNPCS.
ويمكن استخدامها لتمييزها إلى الخلايا العصبية و النسب غير العصبية. لذلك ، أشعر أنه إذا كان ، حقا ، يمكن للناس السيطرة على هذه التقنية من خلال أخذ المساعدة من هذا الفيديو ، سيكون من المفيد حقا للجميع. شكرًا لك.
