この手順の全体的な目標は、E14-E16スプレイグドーレーラット胚から分離された混合一次海馬および皮質ニューロンからの神経球の発達を実証し、様々な神経治療リードの効果を研究するための堅牢で低コストのプラットフォームを提供することです。ご存知のように、その脳は多数の支持細胞に関連するニューロンの複雑なネットワークです。脳機能を理解するために、多くの場合、研究のほとんどは、市販の神経系統由来細胞株を含むin vitro実験から再開始されます。
しかし、この細胞株は、遺伝子質および形質変化に苦しむ形質転換細胞株である。この問題に対処するために、一次ニューロン培養が適切なアプローチである。ここでは、一次ニューロンを培養するためのシンプルで費用対効果の高いプロトコルを示し、様々な神経治療のための堅牢なスクリーニングプラットフォームを構築した。
このプロトコルの主な利点は、細胞めっき密度を調節するだけで、低密度が一次ニューロン培養を長引き、高密度が自発的な神経球を生成する2つの対照的なニューロン培養プラットフォームを紹介できることです。24ウェルプレートを2枚取ります。1つは高密度、もう1つは低密度めっき用です。
24ウェルプレートに12mmの無菌ガラスカバーリップを移します。カバースリップ全体の表面を完全に覆う方法で、各ウェルに300マイクロリットルのPDL溶液を注ぎます。イオン化水中の濃度0.1mg/mLでPDL溶液を調製します。
乾燥を防ぐためにアルミニウムホイルでプレートを包み、一晩CO2インキュベーターに保管してください。翌日、めっきする前に、PDL溶液を吸引する。滅菌水で2~3回きちんと洗います。
次いでメッキ媒体を加え、プレートをめっきするまでインキュベーターに戻す。E14-E16時の妊娠中のスプレイグ・ドーリーラットを犠牲にし、無菌鉗子と鈍い端のはさみを使用して腹部にV字型のカットを行います。すべての胎児を取り除き、慎重に冷たいHBSS溶液でシャートリプレートの上に置きます。
胚嚢から胚を取り出し、新鮮で冷たいHBSSで別のシャーレで慎重に洗います。無菌はさみの助けを借りて頭を切断します。冷たいHBSSと滅菌90ミリメートルのシャートリプレートにヘッドを転送します。
ステレオ顕微鏡の下で、無菌鋸歯状鉗子でスナット領域から頭部を保持し、皮膚と頭蓋骨を切り開いて脳を取り出す。脳幹を保持することにより、半球と中脳からすべての髄を除去します。海馬と皮質を含むキノコの帽子に似た無傷の半球を慎重に取り除きます。
10 mLの解離媒体を含む15 mL円錐形管に皮質と無傷の海馬を含む半球を集める。採取した組織が落ち着き、解離培地を吸引し、培地の5~10%を残す。再び、10 mLの新鮮な解離媒体を加え、このステップを2回繰り返します。
解離媒体4.5mLと0.5mLのトリプシン-EDTA溶液を加えます。消化が進むには、37°Cで20分間保育器に入れておいてください。培地を吸引し、10mLの解離媒体とめっき培地で連続して洗浄する。
2.5mLのめっき培地で再懸濁します。皿の逆蓋の上に90ミリメートルの無菌皿を保ち、90ミリメートルの滅菌皿のベースに注ぎます。消化した組織を皿の隅の基部に、1000マイクロリットルピペットチップを使用して、最も少ない体積を占めるようにする。
得られた細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して、組織の任意の塊を除く。トリパンブルー色素排除を使用して生存細胞の密度を決定し、自動化されたセルカウンター内のセル数をカウントします。得られた細胞の数を1.5を10に10にして高密度めっきの場合はmL当たり5細胞のパワー、30mLのめっき媒体を含む2つの別々のチューブで低密度めっきの場合は20,000細胞/mLを希釈する。
前に添加しためっき媒体とプレート500マイクロリットルの細胞を各ウェルにめっき培地に分散させた吸引する。その後、プレートをインキュベーターに4時間戻します。めっきの4時間後、顕微鏡下で接着する細胞を調べる。
4時間のめっきの後、高密度および低密度プレートの両方で、ニューロンはプレートに良好な付着を示す。各井戸の培地を500マイクロリットルの新鮮なメンテナンス培地に交換し、37°Cのインキュベーターでインキュベーターに入れ替えます。私たちは、これらのニューロンを高密度と低密度でメッキ培養する必要があります。
低密度めっきニューロンは、週に2回維持媒体を交換することによって、最大30日間、長期培養に使用することができますが、高密度メッキニューロンは、超低添付着プレートで維持した翌日に来た神経球を自発的に生成し始めます。24時間のめっきの後、高密度および低密度めっきニューロンの両方が健康な形態を示すために観察される。低密度めっきニューロンの位相コントラスト画像を、約7日間培養して、ここに表示する。
ニューロンは健康な形態を示し、より活発なルーティングおよび相互接続と30日まで維持することができる。ここでの棒図はMTTアッセイによって決定されるように、培養の30日後でさえ低密度めっきニューロンの約90%の生存率を示す。ここでの主要なニューロンは、区別されたニューロンのマーカーであるTuj 1と、ニューロン軸索のマーカーであるtauを用いて免疫染色することを特徴としている。
ニューロンの純度は、アストロサイトのGFAPおよびオリゴデンドロサイトのO4の非ニューロンマーカーの染色がないことによって確認される。すべての特性評価研究において、核はHoechst 33258で染色されている。ここで、低密度シード細胞は、GFAPと神経マーカーTuj1のアストロサイトマーカーで染色され、培養の純度を7日間までチェックしている。
このプロトコルは、定量分析によって示されるように、アストロサイト上のニューロンの優遇成長をサポートすることが観察される。核は、Hoechst 33258で染色されています。同様に、高密度播種細胞では、アストロサイトはTuj 1によってGFAPおよびニューロンで染色されている。
ここで、定量分析では、83%のニューロンと比較して約17%のアストロサイトが観察される。核は、Hoechst 33258で染色されています。7日後、高密度ニューロンに自発的に形成された複数の神経球が観察される。
培養の8日目から10日目頃、高密度めっきニューロンでは、神経球は大きな突起を形成し始め、放射状グリア様エクステンションからなる橋梁を形成し始める。黒い矢印は、2つの新しく形成された神経球間の橋を示す。生細胞および死細胞アッセイは、神経球上で15日間行われてきた。
緻密なカルセインAM染色では、ヨウ化プロピジウム染色を全く有しないが、培養における神経球のほぼ100%の生存率を示す。ここでの折れ線グラフは、経過日数を伴う神経球の大きさの拡大を示しています。この過度に染色された神経球の画像は、NPCマーカーNestinおよびTuj 1の発現の増加を通じて神経前駆細胞の豊富な集団を示す。
ここでの神経球は、GFAPの強い発現によって特徴づけられる多数のアストロサイトを示し、さらに高い神経マーカーTuj 1の発現を伴う。核は、Hoechst 33258で染色されています。だから私たちのプロトコルは、単一の戦略から2つのプラットフォームを得ることができるという事実を考えると、非常にエキサイティングで興味深いと思います:1つの2-Dと1つの3D。
そして、これは異なる神経治療のトラックをスクリーニングするための素晴らしいプラットフォームになります。だから私はそれが本当にすべての神経科学者に本当に便利だと思います。また、もう一つの重要な側面は、私たちが選ぶ神経球が神経前駆細胞、NPCに非常に豊富であるということです。
そして、それらはニューロンおよび非ニューロン系統にそれらを区別するために使用することができる。だから、私は本当に、人々がこのビデオから助けを取ることによって、この技術を習得することができるならば、それは本当に誰にとっても本当に有用であると感じています。ありがとうございました。
