Bu prosedürün genel amacı, çeşitli nöroterapötik yol ların etkisini incelemek için sağlam ve düşük maliyetli bir platform sunmak amacıyla, E14-E16 Sprague Dawley sıçan embriyosundan izole edilen karışık primer hipokampal ve kortikal nöronlardan nörosferlerin gelişimini göstermektir. Bildiğiniz gibi, bu beyin çok sayıda destekleyici hücreyle ilişkili karmaşık bir nöron ağıdır. Beyin fonksiyonlarını anlamak için, genellikle araştırmanın çoğu, ticari olarak mevcut nöral soy hücre hatları içeren in vitro deneyler, yeniden başlatılır.
Ancak, bu hücre çizgileri genotipik ve henotypic varyasyonları muzdarip hücre hatları dönüştürülür. Bu sorunları gidermek için, birincil nöron kültürü uygun bir yaklaşımdır. Burada, kültür birincil nöronlar için basit ve uygun maliyetli bir protokol resimli ve çeşitli nöral terapötikler için sağlam bir tarama platformu inşa.
Bu protokolün en büyük avantajı, sadece hücre kaplama yoğunluklarını modüle ederek, düşük yoğunluklu ların uzun süreli birincil nöron kültürüne yol açtığı ve yüksek yoğunluklu spontan nörosferler ürettiği iki zıt nöron kültür platformlarını sergileyebiliyor olmamızdır. İki tane 24 kuyu tabak al. Biri yüksek yoğunluklu kaplama için, diğeri de düşük yoğunluklu kaplama için.
24 kuyulu plakalarda 12 mm steril cam kapaklı dudak aktarın. Kuyuların her birine 300 mikrolitre PDL çözeltisi dökün. Deiyonize suda 0.1 mg/mL konsantrasyonda PDL çözeltisini hazırlayın.
Kurutmayı önlemek için plakaları alüminyum folyolarla sarın ve bir gecede CO2 kuluçka makinesinde saklayın. Ertesi gün, kaplama önce, PDL çözeltisi aspire. Steril suile 2-3 kez iyice yıkayın.
Sonra kaplama medya ekleyin ve kaplama kadar kuvöz plakaları iade edin. Kurban bir E14-E16 zamanlı hamile Sprague-Dawley sıçan, steril forceps ve künt uçlu makas bir çift kullanarak karın bölgesinde V şeklinde kesim olun. Tüm fetusları çıkarın ve soğuk HBSS çözeltisi ile petri plakaüzerine dikkatlice yerleştirin.
Embriyoları embriyonik keselerden alın ve taze, soğuk HBSS'de ayrı bir petri kabında dikkatlice yıkayın. Steril makas yardımıyla başının kafasını koparın. Soğuk HBSS ile steril 90 mm petri plakalarda kafaları aktarın.
Stereo mikroskop altında, steril tırtıklı forceps ile prout bölgeden baş tutun ve deri ve kafatası açık keserek beyin çıkarmak. Beyin sapını tutarak hemisfer ve orta beyindeki tüm menenjleri çıkarın. Dikkatle hipokampus ve korteks içeren mantar kapakları benzeyen, bozulmamış hemisfer kaldırın.
10 mL dissosyasyon ortamı içeren 15 mL konik tüpte korteks ve bozulmamış hipokampus içeren hemisferleri toplayın. Toplanan dokuların yerleşmesine izin verin ve ayrışma ortamını aspire edin, içinde ortamın %5-10'unu bırakarak. Yine, 10 mL taze dissociation orta ekleyin ve bu adımı iki kez tekrarlayın.
4,5 mL dissosilasyon ortave 0,5 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Sindirimin devam etmesi için 37 derecede kuvözde 20 dakika bekletin. Orta aspire ve ayrışma orta ve kaplama orta 10 mL ile yıkama, ardışık.
2,5 mL kaplama orta onları yeniden askıya alın. Yemeğin ters kapağının üzerinde 90 mm steril bir çanak tutun ve 90 mm steril çanak tabanına dökün. En az hacimli olacak şekilde 1000 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak yemeğin köşe tabanındaki sindirilmiş dokuları titre edin.
Elde edilen hücre süspansiyonu 70 mikrometre hücre süzgecinden geçirin, doku parçaları hariç. Trypan mavi boya hariç tutma kullanarak canlı hücrelerin yoğunluğunu belirleyin ve otomatik hücre sayacındaki hücre sayısını sayın. Yüksek yoğunluklu kaplama için mL başına 5 hücrenin gücüne 1,5'i 10'a, düşük yoğunluklu kaplama için ise 30 mL kaplama lı iki ayrı tüpte düşük yoğunluklu kaplama için 20.000 hücreye kadar 10'a kadar seyreltin.
Aspire daha önce eklenen kaplama orta ve plaka hücrelerin in 500 mikrolitre her kuyuda kaplama ortamda dağınık. Ondan sonra, plakaları dört saat boyunca kuvöze geri ver. Kaplamadan dört saat sonra, hücreleri mikroskop altında yapışma için inceleyin.
Kaplama dört saat sonra, hem yüksek hem de düşük yoğunluklu plakalar, nöronlar plakaları iyi yapışma gösterir. Her kuyudaki ortamı 500 mikrolitre taze bakım ortamıyla değiştirin ve 37 santigrat derecede bir kuluçka makinesine yatırın. Bu nöronların yüksek ve düşük yoğunluklu olması için kültür ümüz var.
Düşük yoğunluklu kaplama nöronlar uzun kültürler için kullanılabilir iken, kadar 30 gün, haftada iki kez bakım ortamı değiştirerek, yüksek yoğunluklu kaplama nöronlar kendiliğinden nörosferler üretmeye başlar, biz ultra-düşük eki plaka muhafaza sonra gün geldi. Kaplama 24 saat sonra, hem yüksek ve düşük yoğunluklu kaplama nöronlar sağlıklı morfoloji görüntülemek için gözlenmektedir. Düşük yoğunluklu kaplama nöronların faz kontrast görüntüsü, yaklaşık yedi gün boyunca kültürlü, burada görüntülenir.
Nöronlar sağlıklı morfoloji görüntüler ve daha güçlü yönlendirme ve ara bağlantılarla 30 güne kadar korunabilir. Buradaki çubuk diyagramı, MTT analizi tarafından belirlenen 30 günlük kültürden sonra bile düşük yoğunluklu kaplamanların yaklaşık yüzde 90 canlılığını gösteriyor. Birincil nöronlar burada Tuj ile immünboyama ile karakterize edilmiştir 1, farklılaşmış nöronların bir belirteç, ve tau, nöronal aksonların bir belirteç.
Nöronların saflığı astrositler için nöronal belirteçler GFAP ve oligodendrocytes için O4 boyama yokluğu ile doğrulanır. Tüm karakterizasyon çalışmalarında çekirdekler Hoechst 33258 ile boyanmış. Burada, düşük yoğunluklu tohumlu hücreler yedi güne kadar kültürün saflığını kontrol etmek için astrositik marker GFAP ve nöronal marker Tuj 1 ile boyanmıştır.
Bu protokolün kantitatif analizde belirtildiği gibi nöronların astrositler üzerinde tercihli büyümesini desteklediği görülmektedir. Çekirdekler Hoechst 33258 ile lekelenmiştir. Benzer şekilde, yüksek yoğunluklu tohumlu hücrelerde, astrositler Tuj 1 tarafından GFAP ve nöronlar ile boyanmış.
Burada, kantitatif analizde, yaklaşık yüzde 17 astrosit, %83 nöronla karşılaştırıldığında gözlenmektedir. Çekirdekler Hoechst 33258 ile lekelenmiştir. Yedi gün sonra, spontan yüksek yoğunluklu nöronlarda birden fazla nörosfer oluşan gözlenir.
Kültürün sekizinci ila onuncu günü, yüksek yoğunluklu kaplama nöronların, nörosferler radyal glial benzeri uzantıları oluşan büyük projeksiyonlar ve köprüler oluşturmaya başlar. Siyah oklar yeni oluşmuş iki nörosfer arasındaki köprüyü gösteriyor. Canlı ve ölü hücre tnonu 15 gündür nörosferlerde yapılıyor.
Yoğun Calcein boyama, kesinlikle hiçbir propidium iyodür boyama ile, kültürde nörosferlerin neredeyse yüzde 100 canlılık gösterir. Buradaki çizgi grafiği, gün sayısının geçişiyle birlikte nörosferlerin büyüklüğünde bir genişleme olduğunu gösteriyor. Nörosferin bu aşırı lekeli görüntü NPC belirteçleri Nestin ve Tuj 1 artan ifade yoluyla nöral progenitor hücrelerinin zengin bir nüfus gösterir.
Nörosferler burada astrositlerin yüksek miktarda GFAP güçlü ifade ile işaretlenmiş göstermek, nöronal marker Tuj daha yüksek bir ifade eşliğinde 1. Çekirdekler Hoechst 33258 ile lekelenmiştir. Bu yüzden protokolümüzün oldukça heyecan verici ve ilginç olduğunu düşünüyorum, tek bir stratejiden iki platform elde edebildiğimiz gerçeğini göz önünde bulundurursak: biri 2-B ve bir 3-B.
Ve bu farklı nöroterapötik parça tarama için harika bir platform olacak. Sanırım tüm nörologlar için gerçekten yararlı. Ayrıca bir başka önemli yönü biz tercih nörosferler nöral progenitor hücreleri açısından son derece zengin olmasıdır, NPCs.
Ve onları nöronlar ve nöronal olmayan soylara ayırmak için kullanılabilirler. Bu yüzden, eğer insanlar bu videodan yardım alarak bu teknikte ustalayabiliyorsa, herkes için gerçekten yararlı olacağını hissediyorum. Teşekkürler.
