이 절차의 전반적인 목표는 다양한 신경 치료 리드의 효과를 연구하기위한 견고하고 저렴한 플랫폼을 제공하기 위해 E14-E16 Sprague Dawley 쥐 배아에서 분리 된 혼합 1 차 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구체의 발달을 입증하는 것입니다. 아시다시피, 뇌는 많은 수의 지원 세포와 관련된 뉴런의 복잡한 네트워크입니다. 뇌 기능을 이해 하려면, 종종 연구의 대부분은 시험 관 실험에서 다시 시작, 시판 되 고 사용할 수 있는 신경 계보 파생 된 세포주를 포함.
그러나, 이 세포주는 genotypic 및 phenotypic 변이로 손해를 입는 세포주를 변형합니다. 이 문제를 해결 하기 위해, 기본 신경 문화는 적합 한 접근. 여기에서, 우리는 1 차적인 신경세포를 배양하기 위하여 간단하고 비용 효과적인 프로토콜을 설명하고 각종 신경 치료단을 위한 강력한 검열 플랫폼을 구축했습니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 세포 도금 밀도를 조절하는 것만으로저밀도가 장기간 1차 신경 배양으로 이어지고 고밀도가 자발적인 신경구를 생성하는 두 개의 대조적인 뉴런 배양 플랫폼을 선보일 수 있다는 것입니다. 24웰 플레이트 두 개를 가져 가라. 하나는 고밀도, 저밀도 도금용.
멸균 유리 커버립 12mm를 24웰 플레이트에 옮기. 전체 커버슬립의 표면을 완전히 덮는 방식으로 각 웰에 300 마이크로리터의 PDL 용액을 붓습니다. 탈온화 된 물에 0.1 mg / mL의 농도로 PDL 용액을 준비합니다.
알루미늄 호일로 플레이트를 감싸서 건조를 방지하고 하룻밤 동안 CO2 인큐베이터에 보관하십시오. 다음 날, 도금 전에 PDL 솔루션을 흡인합니다. 멸균물로 2~3회 제대로 씻으시다.
그런 다음 도금 매체를 추가하고 도금 될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 반환합니다. E14-E16 시간 임신 한 Sprague-Dawley 쥐를 희생하고 멸균 집게와 무딘 끝 가위를 사용하여 복부 부위의 V 자형 컷을 만듭니다. 모든 태아를 제거하고 조심스럽게 차가운 HBSS 용액으로 페트리 플레이트에 놓습니다.
배아 주머니에서 배아를 꺼내 서 신선한, 차가운 HBSS에서 별도 페트리 접시에 그들을 정중 하 게 세척. 멸균 가위의 도움으로 머리를 참수. 차가운 HBSS로 멸균 90mm 페트리 플레이트에 머리를 옮춥춥시다.
스테레오 현미경의 밑에, 멸균 톱니모양의 집게로 주아웃 부위에서 머리를 잡고, 피부와 두개골을 잘라서 뇌를 꺼낸다. 뇌간을 잡고 반구와 중뇌에서 모든 수막을 제거합니다. 해마와 피질이 들어 있는 버섯 캡을 닮은 그대로 반구를 조심스럽게 제거하십시오.
10mL의 해리 미디어를 포함하는 15mL 원심관에서 피질과 그대로 해마를 포함하는 반구를 수집합니다. 수집된 조직이 정착하고 해리 매체를 흡인하여 배지의 5~10%를 그대로 둡시합니다. 다시, 그것에 신선한 해리 매체의 10 mL을 추가하고 두 번이 단계를 반복합니다.
4.5mL의 해리 매체와 트립신-EDTA 용액의 0.5mL를 추가합니다. 소화가 진행될 수 있도록 섭씨 37도에서 인큐베이터에 보관하십시오. 배지를 흡기하고 10mL의 해리 매체및 도금 매체로 연속적으로 세척한다.
도금 매체의 2.5mL에서 다시 중단하십시오. 90mm 멸균 접시를 접시의 반전 커버 위에 보관하고 90mm 멸균 접시에 붓습니다. 1000 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 접시의 모퉁이 베이스에 소화된 조직을 적티드하여 최소 볼륨을 차지합니다.
70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 얻어진 세포 현탁액을 통과하여 조직의 덩어리를 제외합니다. trypan 블루 염료 제외를 사용하여 실행 가능한 세포의 밀도를 결정하고 자동화 된 세포 카운터에서 셀 수를 계산합니다. 고밀도 도금용 mL당 5세포의 전력으로 1.5~10을 플레이트로 플레이트할 수 있도록, 30mL의 도금을 함유한 2개의 별도 튜브에서 저밀도 도금에 대해 mL당 20, 000세포를 희석한다.
이전에 첨가된 도금 매체및 플레이트 500 마이크로리터를 각각 웰에 도금 매체에 분산시흡시한다. 그 후, 4 시간 동안 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 도금 후 4 시간, 현미경에서 준수세포를 검사.
4시간 동안 도금 후, 고밀도 플레이트와 저밀도 플레이트 모두에서 뉴런은 플레이트를 잘 준수합니다. 각 우물의 배지를 신선한 유지 보수 매체의 500 마이크로리터로 교체하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 인큐베이션합니다. 우리는 고밀도 및 저밀도에서 도금이러한 뉴런을 문화해야합니다.
저밀도 도금 뉴런은 장기간 배양에 사용할 수 있지만, 최대 30일, 일주일에 두 번 유지 보수 매체를 변경하여 고밀도 도금 뉴런이 신경구를 자발적으로 생성하기 시작하며, 이는 초저부착 플레이트에서 유지한 지 하루 만에 나온 것입니다. 도금 24시간 후, 고밀도 및 저밀도 도금 뉴런 모두 건강한 형태를 나타내기 위해 관찰됩니다. 약 7일 동안 배양된 저밀도 도금 뉴런의 상 대비 이미지가 여기에 전시되어 있다.
뉴런은 건강한 형태를 나타내며, 더 활발한 라우팅 및 상호 연결로 최대 30일까지 유지할 수 있습니다. 여기서 바 다이어그램은 MTT 분석에 의해 결정된 바와 같이 30일 간의 문화 후에도 저밀도 도금 뉴런의 약 90%의 생존력을 보여줍니다. 여기에서 1 차적인 뉴런은 Tuj 1, 분화한 뉴런의 마커, 및 타우, 신경 축축의 마커를 가진 면역 염색에 의해 특징지어졌습니다.
뉴런의 순도는 성상세포에 대한 비신경 마커 GFAP및 올리고드로키테스에 대한 O4의 염색이 없는 것으로 확인된다. 모든 특성화 연구에서 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 여기서, 저밀도 종자 세포는 성상체 마커 GFAP 및 신경 마커 Tuj 1로 염색되어 최대 7일까지 배양의 순도를 확인하였다.
이 프로토콜은 정량 분석을 통해 표시된 대로 성상세포에 대한 뉴런의 우대 성장을 지원하는 것으로 관찰된다. 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 유사 하 게, 고밀도 씨드 세포에서, 성상 세포는 Tuj에 의해 GFAP와 뉴런으로 염색 되었습니다 1.
여기서, 정량 분석에서, 약 17% 성상세포는 83% 뉴런에 비해 관찰됩니다. 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 7 일 후, 고밀도 뉴런에서 자발적으로 형성 된 여러 신경 구가 관찰된다.
문화의 약 8~10일, 고밀도 도금 뉴런에서 신경권은 방사형 신경교와 같은 확장으로 구성된 큰 투영과 다리를 형성하기 시작합니다. 검은 화살은 새로 형성된 두 개의 신경구 사이의 다리를 나타냅니다. 살아 있는 죽은 세포 분석은 15 일 동안 신경구에 수행되었습니다.
조밀한 Calcein AM 염색에서, 절대적으로 더 프로디듐 요오드 얼룩, 문화에서 신경 구체의 거의 100 % 생존력을 나타냅니다. 여기서 선 그래프는 일 수의 통과와 신경 구의 크기의 확장을 나타냅니다. 신경권의 이 지나치게 얼룩진 심상은 NPC 마커 네스테인과 Tuj 1의 증가한 발현을 통해 신경 전구 세포의 풍부한 인구를 나타냅니다.
여기에 신경구는 GFAP의 강한 발현에 의해 표시 된 성상세포의 높은 금액을 보여줍니다, 신경 마커 Tuj의 더 높은 발현과 함께 1. 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 그래서 저는 단일 전략에서 2-D 와 3-D 라는 두 개의 플랫폼을 얻을 수 있다는 사실을 고려할 때 우리의 프로토콜이 매우 흥미롭고 흥미롭다고 생각합니다.
그리고 이것은 다른 신경 치료 트랙을 선별하기위한 훌륭한 플랫폼이 될 것입니다. 그래서 모든 신경 과학자에게 정말 유용 할 것 같아요. 또 다른 중요한 측면은 우리가 선택하는 신경구가 신경 전구 세포, NPC가 매우 풍부하다는 것입니다.
그리고 그들은 뉴런과 비 신경 혈통으로 그들을 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 그래서, 정말, 사람들이이 비디오에서 도움을 복용하여이 기술을 마스터 할 수 있다면, 그것은 모든 사람에게 정말 유용 할 것입니다 생각합니다. 감사합니다.
