هذا البروتوكول هو مناسبة للتحقيق حيث البروتينات presynaptic تنشأ: خلايا الأجسام أو محاور. وكيف تتراكم البروتينات presynaptic في presynapses بطريقة منظمة خلال تشكيل المشبك. يمكن أن تحفز هذه التقنية الآلاف من presynapses في نفس الوقت ، ولا تستخدم أي جهاز خاص للحفاظ على محاور في الثقافة مما يسمح بتحليل فعال لتشكيل العديد من presynapses في محاور عصبية.
جنبا إلى جنب مع طالب الدراسات العليا، هونامي، مما يدل على هذا الإجراء سيكون ري إيشي، وهو طالب جامعي في مختبري. ابدأ هذا الإجراء باستخدام القتل الرحيم للماوس كما هو موضح في بروتوكول النص. تشريح البطن للحصول على الأجنة E16.
إزالة العقول من الأجنة بعناية مع مساعدة من ملقط غرامة يميل، ونقلها إلى أطباق ثقافة الخلايا 60 ملليمتر تحتوي على أربعة ملليلتر من محلول الملح الاحتياطي HEPES أو HBSS. إزالة السحايات وقطع لمبة الشم. الكورتيص منفصلة عن كل نصف الكرة الدماغية باستخدام نصائح غرامة من ملقط تحت المجهر ستيريو ونقلها إلى طبق آخر 60 ملليمتر تحتوي على HBSS الطازجة.
استخدام ما لا يقل عن ثلاثة إلى خمسة أجنة لكل ثقافة كرة الخلايا العصبية منفصلة. قطع الكورتيصات إلى قطع صغيرة مع مقص الربيع microdissecting في غطاء ثقافة خلية تدفق لارينار. الآن، نقل الكورنيش المفروم إلى أنبوب 15 ملليلتر.
Trypsinize الكورتيز المفروم في أربعة ملليلتر من 0.125٪ التربسين في HBSS لمدة 4.5 دقائق في حمام مائي في 37 درجة مئوية. نقل مجاميع الخلية إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من HBSS عن طريق ماصة نقل معقمة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل تكرار هذه الخطوة مرة أخرى.
ثم نقل مجاميع الخلية إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر تحتوي على مليلترين من متوسطة NGB، 0.01٪ DNase I، ومصل الحصان 10٪. Triturate الكورتيص التربسينيد عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا لهم صعودا وهبوطا من ثلاث إلى خمس مرات باستخدام ماصة الزجاج الناعم المصقول النار. لتحضير كرات الخلايا العصبية، قم بضبط كثافة الخلايا في تعليق الخلايا إلى مليون خلية لكل ملليلتر باستخدام وسيط NGB.
إضافة سبعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى الجزء السفلي من الأطباق الثقافة. ثقافة الخلايا العصبية القشرية كما 10 قطرات microliter شنقا تحتوي على 10،000 خلية لكل قطرة داخل الأغطية العليا من أطباق الثقافة 10 سنتيمترات. الحفاظ على الأطباق في حاضنة لمدة ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في ظل ظروف مرطبة للسماح لتشكيل الكرة العصبية.
معطف بولي-L-ليسين أو PLL على غطاء الزجاج البارافين مطرز ينزلق في أطباق 60 ملليمتر باستخدام 15 ميكروغرام لكل ملليلتر PLL الحل في المخزن المؤقت بورات. احتفظ بها لمدة ساعة واحدة على الأقل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. بعد الغسيل أربع مرات مع برنامج تلفزيوني، ونقل زلات غطاء PLL المغلفة إلى لوحة أربعة بئر تحتوي على 350 ميكرولترات من متوسطة NGB مع ثلاثة AraC micromolar في كل بئر.
تتم إضافة AraC إلى وسائل الإعلام لقتل الخلايا المنقسمة. احتضان لوحات أربعة آبار تحتوي على غطاء PLL المغلفة زلات في حاضنة CO2 لمدة 20 دقيقة على الأقل لضمان درجة حرارة المتوسطة تصل إلى 37 درجة مئوية قبل نقل كرات الخلايا العصبية. في DIV 3 عندما يتم تشكيل كرات الخلايا العصبية بشكل جيد للغاية، ونقلها على زلات غطاء مغلفة PLL.
داخل لوحة أربعة جيدا، إضافة خمس كرات الخلايا العصبية في بئر. في DIV 11 نقل 20 ميكرولترات من تعليق الجسيمات المغناطيسية المغلفة streptavidin إلى أنبوب microcentrifuge. قم بشل تثبيت الخرز إلى جهاز مصنوع يدويًا مرفقًا بمغناطيسات النيوديميوم الدائمة ويغسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر من PBS-MCBC في أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر.
بعد إزالة تماما PBS-MCBC من الخرز، إضافة حجم محدد سلفا من مخزون LRRTM2 إلى الخرز غسلها. احتضان الخليط باستخدام دوار في أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد الحضانة، وغسل الخرز مرتين مع 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني MCBC.
ثم، وغسل الخرز مع 100 ميكروليتر من متوسطة NGB. Resuspend الخرز LRRTM2 في 50 ميكرولترات من ني جي بي المتوسطة لتطبيقها على ثقافة الكرة العصبية. الآن قطع نهاية طرف أصفر في زاوية 45 درجة مع شفرة الحلاقة تحت المجهر ستيريو.
وضع الطرف الأصفر على منطقة الجسم الخلية من الكرة العصبية وإزالة الهيئات الخلية عن طريق الشفط. تطبيق LRRTM2 والخرز التحكم على ثقافة الكرة العصبية. ثم غمر الخرز إلى الجزء السفلي من لوحات من ثقافة الكرة العصبية لمدة دقيقة واحدة باستخدام مغناطيس الفريت لبدء تشكيل ما قبل المشبك.
هذا الإجراء يضمن لهبوط جميع الخرز في نفس الوقت. إصلاح وصمة عار في الخلايا العصبية في ثقافة الكرة العصبية بعد تشكيل ما قبل المشبك مع الخرز كما هو موضح في بروتوكول النص. التقط تباين التداخل التفاضلي وصور الفلوروسنس المناعي تحت مجهر فلوري مقلوب مع كاميرا CCD مبردة باستخدام عدسة غمر الزيت 60X.
قياس كثافة المناعة في ما قبل نقاط الاشتباك العصبي في محور عصبي. استخدام كثافة المناعة من المنطقة ذات الاهتمام على الخرز. ناقص قبالة الخرز كثافة المنطقة مقسمة من شدة محور عصبي، على طول 20 ميكرون من الخرز.
ناقص كثافة الخلفية. هذه الكثافة نسبة يوفر مؤشر تراكم البروتين. لتحديد مستوى تراكم بروتين معين في presynapse المستحثة بخرز LRRTM2 ، حدد دائمًا المنطقة التي هي حقلين من الرؤية أو أكثر بصرف النظر عن جسم الخلية.
لقياس دقيق، اختر خمسة حقول مختلفة محور عصبي لكل غطاء. يظهر هنا هو تطبيق الخرز LRRTM2 في ثقافة الكرة العصبية في DIV 11 الناجمة تراكم Munc18-1 في presynapses من محاور من كرات الخلايا العصبية. الخرز على محاور من كرات الخلايا العصبية مرئية في صور المجهر المرحلة.
ويلاحظ تراكم البروتينات presynaptic من خلال الصور immunofluorescence. حتى في المحاور التي يتم إزالة الأجسام الخلية، لوحظ تراكم Munc18-1 تحت الخرز، على غرار محاور من كرات الخلايا العصبية مع الهيئات الخلية. عندما تم تحليل المنطقة الطرفية من ورقة محور عصبي من قبل عدسة الهدف التكبير عالية، vGlut1 و Munc18-1 تراكمت بوضوح في presynapses من المحاور تحت الخرز مع وبدون أجسام الخلية.
أثبتت تجارب الدورة الزمنية أن تراكم vGlut1 في presynapses زاد بشكل كبير في 30 دقيقة. ومن ناحية أخرى، بدأ تراكم Munc18-1 في الزيادة بشكل ملحوظ في ساعتين ووصل إلى الهضبة في أربع ساعات. وتشير هذه البيانات إلى أن بروتين الهدابيك التشابكي vGlut1 يتراكم في presynapses في وقت سابق من البروتين المنطقة النشطة Munc18-1.
وKosynapses تراكم Munc18-1 من الخلايا العصبية Fmr1-KO زيادة 1.5 مرات أكثر من تلك الموجودة في نوع البرية, مما يدل على تورط FMRP في تراكم Munc18-1. مثبط تخليق البروتين, أنيسومايسين, قمعت تراكم Munc18-1 بشكل كبير في محاور عصبية مع وبدون أجسام الخلايا. وهذا يشير إلى أن تراكم البروتين هو التوليف تعتمد.
الأنابيب الكورتيص التربسينized باستخدام ماصة الزجاج الناعم المصقول باستور النار هو خطوة هامة. يقوم المجربون بإعداد الماصات المصقولة بالنيران بقطرين إلى ثلاثة أقطار مختلفة، واختاروا ماصة بقطر مناسب. باستخدام هذا الإجراء، يتم قياس الافراج متشابك من presynapses الناجمة عن الخرز LRRTM2 عن طريق التصوير الحي.
هذه الطريقة الإضافية من شأنها أن الإجابة ما إذا كان البروتين التوليف في محاور عصبية وتشارك في تنظيم إطلاق متشابك. باستخدام هذه الطريقة، يدرس الباحثون كيف تتراكم البروتينات presynaptic في presynapses بطريقة منظمة، فضلا عن موقع مصدر البروتينات presynaptic.
