Этот протокол подходит для исследования того, где происходят пресинаптические белки: клеточные тела или аксоны. И как пресинаптические белки накапливаются в пресинапсах организованным образом во время формирования синапса. Этот метод может вызвать тысячи пресинапсов в то же время, и не использует какой-либо специальный аппарат для поддержания аксонов в культуре позволяет эффективный анализ формирования многих презинапсов в аксоны.
Вместе с аспирантом Хонами, демонстрируя эту процедуру, будет Рие Исии, студент моей лаборатории. Начните эту процедуру с эвтаназии мыши, как описано в текстовом протоколе. Рассекаете живот, чтобы получить эмбрионы E16.
Удалите мозг из эмбрионов тщательно с помощью тонкой наконечником типсов, и передать их в 60-миллиметровой клеточной культуры блюда, содержащие четыре миллилитров HEPES буферного раствора соли или HBSS. Снимите околис и вырежьте обонятельную луковицу. Отдельные кортисы из каждого полушария головного мозга с использованием тонких кончиков типсов под стерео микроскопом и передачи на другой 60-миллиметровый блюдо, содержащее свежие HBSS.
Используйте по крайней мере три-пять эмбрионов для каждой отдельной культуры нейронного шара. Разрежьте кортис на мелкие кусочки с микродиссекцией весенних ножниц в ламинарном капюшоне культуры потока. Теперь перенесите рубленые кортисы в 15-миллилитровую трубку.
Трипсинизировать фарш кортис в четырех миллилитров 0,125%трипсина в HBSS в течение 4,5 минут в водяной бане при 37 градусов по Цельсию. Перенесите агрегаты клеток в новую 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров HBSS стерильной трубой передачи. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут, прежде чем повторить этот шаг еще раз.
Затем перенесите агрегаты клеток в новую 15-миллилитровую трубку, содержащую два миллилитров NGB среднего, 0,01% DNase I и 10%лошадиную сыворотку. Тритурат трипсинизированных кортишей, неоднократно трубы их вверх и вниз три-пять раз с помощью огнеполированной тонкой стеклянной пипетки Пастера. Для подготовки нейронных шаров, настроить плотность клеток в клеточной подвески до одного миллиона клеток на миллилитр с помощью NGB среды.
Добавьте семь миллилитров PBS в нижнюю часть культурных блюд. Культура корковых нейронов, как 10 микролитер висячие капли, содержащие 10000 клеток на каплю внутри верхних крышек 10-сантиметровой культуры блюд. Держите блюда в инкубаторе в течение трех дней при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 в увлажненных условиях, чтобы обеспечить образование нейронного шара.
Пальто поли-L-лизин или PLL на парафин бисером стеклянная крышка скользит в 60-миллиметровых блюд с использованием 15 микрограмм на миллилитр PLL раствор в буфере бората. Держите их в течение по крайней мере одного часа в инкубаторе CO2 при 37 градусах по Цельсию. После мытья четыре раза с PBS, передача PLL покрытием крышки скользит на четыре хорошо пластины, содержащие 350 микролитров NGB среды с тремя микромолярной AraC в каждой хорошо.
AraC добавляется в средства массовой информации, чтобы убить разделительные ячейки. Инкубировать четыре хорошо пластин, содержащих PLL покрытие скользит в инкубаторе CO2, по крайней мере 20 минут, чтобы обеспечить температуру среды достигает 37 градусов по Цельсию перед передачей нейрон шаров. На DIV 3, когда нейрон шары образуются очень хорошо, передать их на PLL покрытием крышки скользит.
Внутри четырех-хорошо пластины, добавить пять нейронов шары на колодец. При DIV 11 передают 20 микролитров из подвески магнитных частиц со стрептавидином в микроцентрифугную трубку. Обездвижить бисер к аппарату ручной работы, прикрепленного с постоянными магнитами неодимия, и трижды промыть 100 микролитров PBS-MCBC в 1,5-миллилитровых микроцентрифуговых трубках.
После полного удаления PBS-MCBC из бисера, добавить предопределенный объем запасов LRRTM2 в вымытые бусы. Инкубировать смесь с помощью ротатора при четырех градусах по Цельсию в течение одного-двух часов. После инкубации, мыть бисер дважды с 100 микролитров PBS-MCBC.
Затем вымойте бисер 100 микролитров ngB среды. Resuspend шарики LRRTM2 в 50 микролитров среды NGB для применения к культуре шарика нейрона. Теперь вырежьте конец желтого кончика под углом 45 градусов лезвием бритвы под стерео микроскопом.
Положите желтый конец кончика на клеточной области тела нейрона мяч и удалить тела клеток путем всасывания. Применить LRRTM2 и контролировать бисер на нейронов мяч культуры. Затем погрузите шарики в нижней части пластин нейрона мяч культуры в течение одной минуты с помощью ферритовых магнитов, чтобы начать предварительное образование синапса.
Эта процедура обеспечивает приземление всех бусин одновременно. Исправить и пятно нейронов в нейроне мяч культуры после предварительного формирования синапса с бисером, как описано в текстовом протоколе. Захват дифференциального интерференционного контраста и иммунофлуоресценции изображений под перевернутым флуоресцентным микроскопом с помощью охлажденой камеры CCD с помощью объектива погружения масла 60X.
Измерьте интенсивность иммунофторесценции в предсинапсах в аксоне. Используйте иммунофлуоресценции интенсивности области интереса на бисер. Минус интенсивность области бусин, разделенных на аксональной интенсивности, вдоль 20 микрон из бисера.
Минус фоновая интенсивность. Эта интенсивность соотношения обеспечивает индекс накопления белка. Для количественной оценки уровня накопления определенного белка в пресинапсе, индуцированном бисером LRRTM2, всегда выберите область, которая является двумя полями зрения или более отдельно от клеточного тела.
Для точного измерения выберите пять различных аксональных полей на крышку. Здесь показано применение LRRTM2 шариков в культуру нейронного шара на DIV 11 индуцированного накопления Munc18-1 в presynapses аксонов нейронных шаров. Бусы на аксонах нейронных шаров видны на изображениях фазовой микроскопии.
А накопление пресинаптических белков наблюдается по изображениям иммунофлюоресценции. Даже в аксонах, которые удаляются клеточные тела, накопление Munc18-1 наблюдалось под бисером, похожим на аксоны нейронных шаров с клеточными телами. Когда периферическая область аксонального листа была проанализирована высоким увеличением объективной линзы, vGlut1 и Munc18-1 накопились четко в пресинапсах аксонов под бисером с и без клеточных тел.
Эксперименты курса времени показали, что накопление vGlut1 в пресинапсах значительно увеличилось на 30 минут. С другой стороны, накопление Munc18-1 начало значительно увеличиваться в два часа и достигло плато в четыре часа. Эти данные свидетельствуют о том, что синаптический везикулярный белок vGlut1 накапливается в пресинапсах раньше, чем активный белок зоны Munc18-1.
Накопление Munc18-1 в пресинапсах нейронов Fmr1-KO увеличилось в 1,5 раза больше, чем в диком типе, что свидетельствует об участии FMRP в накоплении Munc18-1. Ингибитор синтеза белка, анисомицин, значительно подавлял накопление Munc18-1 в аксонах с телами клеток и без них. Это указывает на то, что накопление зависит от синтеза белка.
Трубопровод трипсинизированных корти с использованием огнеполированной тонкой стеклянной пипетки Pasteur является важным шагом. Экспериментаторы готовят огнеуемые пипетки двух-трех разных диаметров и выбирают пипетки соответствующего диаметра. Используя эту процедуру, синаптический релиз от пресинапсов, индуцированных бусинками LRRTM2, измеряется живой визуализацией.
Этот дополнительный метод даст ответ на вопрос, участвует ли синтез белка в аксоне в регуляции синаптической высвобождения. Используя этот метод, исследователи изучают, как пресинаптические белки накапливаются в пресинапсах организованным образом, а также расположение источника пресинаптических белков.
