Este protocolo es adecuado para investigar dónde se originan las proteínas presinápticas: cuerpos celulares o axones. Y cómo las proteínas presinápticas se acumulan en las presinapipsas de una manera organizada durante la formación de la sinapsis. Esta técnica puede inducir miles de presinápsias al mismo tiempo, y no utiliza ningún aparato especial para mantener los axones en el cultivo permitiendo un análisis eficiente de la formación de muchas presinepsas en axones.
Junto con el estudiante de posgrado, Honami, demostrando este procedimiento estará Rie Ishii, un estudiante de pregrado en mi laboratorio. Comience este procedimiento con la eutanasia del ratón como se describe en el protocolo de texto. Disecciona el abdomen para obtener embriones E16.
Retire los cerebros de los embriones cuidadosamente con la ayuda de fórceps de punta fina, y transfieralos a platos de cultivo celular de 60 milímetros que contengan cuatro mililitros de solución de sal tamponada HEPES o HBSS. Retire las meninges y corte la bombilla olfativa. Separe los cortices de cada hemisferio cerebral utilizando las puntas finas de los fórceps bajo el microscopio estéreo y transfiera a otro plato de 60 milímetros que contenga HBSS fresco.
Utilice al menos de tres a cinco embriones para cada cultivo de bola de neurona separado. Corte los cortices en trozos pequeños con tijeras de resorte microdisección en una capucha de cultivo de células de flujo laminar. Ahora, transfiera los cortices picados a un tubo de 15 mililitros.
Trypsinize los cortices picados en cuatro mililitros de 0.125%trypsin en HBSS durante 4.5 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius. Transfiera los agregados celulares a un nuevo tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de HBSS mediante una pipeta de transferencia estéril. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos antes de repetir este paso una vez más.
Luego transfiera los agregados celulares a un nuevo tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de medio NGB, 0.01%DNase I, y 10%caballos de suero. Triturar los cortices tripsias pipetándolos repetidamente hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces usando una pipeta Pasteur de vidrio fino pulido al fuego. Para preparar bolas de neurona, ajuste la densidad celular en la suspensión celular a un millón de células por mililitro utilizando el medio NGB.
Añadir siete mililitros de PBS a la parte inferior de los platos de cultivo. Cultiva las neuronas corticales como 10 gotas colgantes de microlitro que contienen 10.000 células por gota dentro de los párpados superiores de los platos de cultivo de 10 centímetros. Mantener los platos en una incubadora durante tres días a 37 grados Celsius con 5%CO2 en condiciones humidificadas para permitir la formación de bolas de neuronas.
Recubrir poli-L-lisina o PLL en la cubierta de vidrio con cuentas de parafina se desliza en platos de 60 milímetros utilizando una solución PLL de 15 microgramos por mililitro en tampón de borato. Guárdalos durante al menos una hora en una incubadora de CO2 a 37 grados centígrados. Después de lavar cuatro veces con PBS, transfiera los resbalones de la cubierta recubiertos de PLL a una placa de cuatro pozos que contenga 350 microlitros de medio NGB con tres AraC micromolares en cada pozo.
AraC se agrega a los medios para matar las células divisorias. Incubar las placas de cuatro pozos que contienen los resbalones de cubierta recubiertos de PLL en la incubadora de CO2 durante al menos 20 minutos para asegurar que la temperatura del medio alcance los 37 grados centígrados antes de transferir las bolas de la neurona. En el DIV 3 cuando las bolas de neurona se forman muy bien, transfiéralas a los resbalones de la cubierta recubiertos de PLL.
Dentro de la placa de cuatro pozos, añadir cinco bolas de neuronas por pozo. En DIV 11 transfiera 20 microlitros de la suspensión de partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina a un tubo de microcentrífuga. Inmovilice las perlas a un aparato hecho a mano unido con imanes permanentes de neodimio y lave tres veces con 100 microlitros de PBS-MCBC en tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitros.
Después de eliminar completamente PBS-MCBC de las perlas, agregue un volumen predeterminado de material LRRTM2 a las perlas lavadas. Incubar la mezcla usando un rotador a cuatro grados centígrados durante una a dos horas. Después de la incubación, lave las cuentas dos veces con 100 microlitros de PBS-MCBC.
A continuación, lave las perlas con 100 microlitros de medio NGB. Resuspender las perlas LRRTM2 en 50 microlitros de medio NGB para su aplicación en el cultivo de bolas de neurona. Ahora corta el extremo de una punta amarilla en ángulo de 45 grados con una cuchilla de afeitar debajo del microscopio estéreo.
Coloque el extremo amarillo de la punta en el área del cuerpo celular de una bola de neurona y retire los cuerpos celulares por succión. Aplique el LRRTM2 y controle las cuentas en el cultivo de la bola de neurona. A continuación, sumerja las cuentas en la parte inferior de las placas del cultivo de la bola de neurona durante un minuto utilizando imanes de ferrita para iniciar la formación de presinapasa.
Este procedimiento garantiza el retoque de todas las cuentas al mismo tiempo. Fijar y manchar las neuronas en el cultivo de la bola de neurona después de la formación de presinapasa con cuentas como se describe en el protocolo de texto. Capture imágenes de inmunofluorescencia y contraste de interferencia diferencial bajo un microscopio fluorescente invertido con una cámara CCD enfriada utilizando una lente de inmersión de aceite 60X.
Mida la intensidad de la inmunofluorescencia en presinapsis en el axón. Utilice intensidades de inmunofluorescencia de la región de interés en las cuentas. Menos la intensidad de la región de las cuentas dividida por la intensidad axonal, a lo largo de 20 micras de las cuentas.
Menos intensidad de fondo. Esta intensidad de relación proporciona el índice de acumulación de proteínas. Para cuantificar el nivel de acumulación de una proteína en particular en una presinapasa inducida con cuentas LRRTM2, seleccione siempre el área que es dos campos de visión o más aparte del cuerpo celular.
Para una medición precisa, elija cinco campos axonales diferentes por cubreobjetos. Aquí se muestra la aplicación de cuentas LRRTM2 en el cultivo de bolas de neurona en la acumulación inducida DIV 11 de Munc18-1 en presinanapses de axones de bolas de neuronas. Las perlas en los axones de las bolas de neuronas son visibles en las imágenes de microscopía de fase.
Y la acumulación de proteínas presinápticas se observa por las imágenes de inmunofluorescencia. Incluso en los axones que se eliminan los cuerpos celulares, la acumulación de Munc18-1 se observó debajo de las cuentas, similar a los axones de las bolas de neurona con cuerpos celulares. Cuando la región periférica de la hoja axonal fue analizada por lente objetivo de alto aumento, vGlut1 y Munc18-1 se acumularon claramente en presynapsas de axones debajo de las cuentas con y sin cuerpos celulares.
Los experimentos de curso de tiempo demostraron que la acumulación de vGlut1 en presynapses aumentó significativamente a los 30 minutos. Por otro lado, la acumulación Munc18-1 comenzó a aumentar significativamente a las dos horas y alcanzó una meseta a las cuatro horas. Estos datos indican que la proteína de vesícula sináptica vGlut1 se acumula en presynapses antes que la proteína de zona activa Munc18-1.
La acumulación Munc18-1 en presinanapses de las neuronas Fmr1-KO aumentó 1,5 veces más que las de tipo salvaje, lo que indica la implicación de FMRP en la acumulación de Munc18-1. Inhibidor de la síntesis de proteínas, anisomycin, suprimió la acumulación Munc18-1 significativamente en axones con y sin cuerpos celulares. Esto indica que la acumulación depende de la síntesis de proteínas.
Pipetear los cortices tripsintanos utilizando una pipeta Pasteur de vidrio fino pulido al fuego es un paso importante. Los experimentadores preparan las pipetas pulidas por el fuego con dos o tres diámetros diferentes, y eligieron una pipeta con un diámetro adecuado. Con este procedimiento, la liberación sináptica de presinápsas inducidas por perlas LRRTM2 se mide mediante imágenes en vivo.
Este método adicional respondería si la síntesis de proteínas en axones está involucrada en la regulación de la liberación sináptica. Utilizando este método, los investigadores examinan cómo las proteínas presinápticas se acumulan en las presinanaps de una manera organizada, así como la ubicación de la fuente de proteínas presinápticas.
