Bu protokol, presinaptik proteinlerin nereden kaynaklandığını araştırmak için uygundur: hücre cisimleri veya aksonlar. Ve sinaps oluşumu sırasında presinaptik proteinlerin düzenli bir şekilde presinapslarda nasıl birikir. Bu teknik aynı anda binlerce presinaps neden olabilir, ve akson birçok presynaps oluşumunun verimli analizi sağlayan kültürde akson korumak için herhangi bir özel cihaz kullanmaz.
Yüksek lisans öğrencisi Honami'nin yanı sıra, bu prosedürü gösteren Rie Ishii, laboratuvarımda lisans öğrencisi olacak. Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi fare ötenazisi ile başlayın. E16 embriyoları elde etmek için karın incelemek.
İnce uçlu forsepsyardımıyla embriyolardan beyni dikkatlice çıkarın ve dört mililitre HEPES tamponlu tuz çözeltisi veya HBSS içeren 60 milimetrelik hücre kültürü yemeklerine aktarın. Menenjitleri çıkarın ve koku ampulü kesin. Stereo mikroskop altında forceps ince uçlarını kullanarak her serebral yarımküreden ayrı korteksler ve taze HBSS içeren başka bir 60 milimetrelik çanak transfer.
Her ayrı nöron topu kültürü için en az üç ila beş embriyo kullanın. Bir laminar akış hücre kültür başlık mikrodissecting bahar makası ile küçük parçalar halinde corticekes. Şimdi, kıymalı korteksleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
HbSS'de %0.125 tripsin olmak için dört mililitre lik kıyma lı kortikleri 37 santigrat derecede bir su banyosunda 4,5 dakika deneyin. Hücre agregalarını steril transfer pipeti ile 10 mililitre HBSS içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlamadan önce 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatın.
Daha sonra hücre agregalarını iki mililitre NGB orta, %0.01 DNase I ve %10 at serumu içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Tepiştirilmiş korteksleri, ateş cilalı ince cam Pasteur pipet'i kullanarak tekrar tekrar üç ila beş kez yukarı ve aşağı borulandırarak triturate. Nöron topları hazırlamak için, NGB orta kullanarak mililitre başına bir milyon hücre hücre hücre süspansiyon hücre yoğunluğunu ayarlayın.
Kültür yemeklerinin alt kısmına yedi mililitre PBS ekleyin. Kültür 10 mikrolitre 10 mikrolitre asılı damla olarak kortikal nöronlar 10 santimetrelik kültür yemekleri üst kapakları içinde damla başına 10.000 hücre içeren. Nören top oluşumuna izin vermek için bulaşıkları 37 santigrat derecede %5 CO2 ile üç gün boyunca bir kuvözde tutun.
Kat poli-L-lizin veya PLL parafin boncuklu cam kapak üzerine 60 milimetrelik yemeklerde borat tampon mililitre PLL çözeltisi başına 15 mikrogram kullanarak final in. 37 santigrat derecede bir CO2 kuluçka makinesinde en az bir saat bekletin. PBS ile dört kez yıkadıktan sonra, PLL kaplı kapak fişlerini her kuyuda üç mikromolar AraC bulunan 350 mikrolitre NGB orta sıyrık içeren dört kuyulu bir plakaya aktarın.
AraC, bölünen hücreleri öldürmek için ortama eklenir. Nöron toplarını transfer etmeden önce ortamın sıcaklığının 37 dereceye ulaştığından emin olmak için CO2 inkübatöründeki PLL kaplı kapak fişlerini içeren dört kuyulu plakaları en az 20 dakika kuluçkaya yatırın. DIV 3'te nöron topları çok iyi oluştuğunda, bunları PLL kaplı kapak fişlerine aktarın.
Dört kuyuplaka içinde, iyi başına beş nöron topları ekleyin. DIV 11'de streptavidin kaplı manyetik partiküllerin süspansiyonundan mikrosantrifüj tüpüne 20 mikrolitre aktarın. Boncukları neodimyum kalıcı mıknatıslarla bağlı el yapımı bir cihaza yerleştirin ve 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 100 mikrolitre PBS-MCBC ile üç kez yıkayın.
PBS-MCBC'yi boncuklardan tamamen çıkardıktan sonra, yıkanmış boncuklara önceden belirlenmiş bir LRRTM2 stokhacmi ekleyin. Karışımı dört santigrat derecede bir rotator kullanarak 1-2 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra boncukları 100 mikrolitre PBS-MCBC ile iki kez yıkayın.
Daha sonra boncukları 100 mikrolitre NGB orta sıyla yıkayın. Nöron topu kültürüne uygulama için NGB orta 50 mikrolitre LRRTM2 boncukre askıya alın. Şimdi 45 derecelik açıyla, stereo mikroskop altında bir jiletle sarı bir ucun ucunu kesin.
Bir nöron topu hücre vücut alanı üzerinde sarı uç ucu koyun ve emme ile hücre organları kaldırın. LRRTM2 uygulayın ve nöron topu kültürü üzerinde kontrol boncuklar. Sonra ön sinaps oluşumu başlatmak için ferrit mıknatıslar kullanarak bir dakika için nöron topu kültürünün plakaları altına boncuk batırın.
Bu yordam, tüm boncukları aynı anda touchdown sağlar. Metin protokolünde açıklandığı gibi boncuklar ile pre-sinaps oluşumu ndan sonra nöronlar düzeltmek ve leke. 60X yağ daldırma lensi kullanarak soğutulmuş ccd kamera ile ters floresan mikroskop altında diferansiyel girişim kontrastı ve immünofloresan görüntüleri yakalayın.
Aksondaki ön sinapslarda immünfloresans yoğunluğunu ölçün. Boncuklar üzerinde ilgi bölgenin immünofloresan yoğunlukları kullanın. Eksi kapalı boncuk bölge yoğunluğu aksonal yoğunluğu ile bölünmüş, boncuk20 mikron boyunca.
Eksi arka plan yoğunluğu. Bu oran yoğunluğu protein birikim indeksi sağlar. LRRTM2 boncukları ile indüklenen bir presinyofaz belirli bir proteinin birikim düzeyini ölçmek için, her zaman görüş iki alan veya hücre gövdesi nden daha fazla alan seçin.
Doğru ölçüm için, coverslip başına beş farklı aksonal alan seçin. Burada gösterilen cd 11 munc18-1 nöron topları aksonların presynapses indüklenen birikimi nde nöron topu kültürüne LRRTM2 boncuk uygulamasıdır. Nöron toplarının aksonları üzerindeki boncuklar faz mikroskopi görüntülerinde görülebilir.
Ve presinaptik proteinlerin birikimi immünoresans görüntüleri tarafından gözlenir. Hücre organları çıkarılan aksonlarda bile, munc18-1 birikimi boncukaltında gözlendi, hücre organları ile nöron topları aksonlar benzer. Aksonal levhanın periferik bölgesi yüksek büyütme nesnel lens, vGlut1 ve Munc18-1 ile analiz edildiğinde, hücre gövdeleri olan ve olmayan boncukların presynapseslerinde açıkça birikti.
Zaman dersi deneyleri presinapslarda vGlut1 birikiminin 30 dakikada önemli ölçüde arttığını göstermiştir. Öte yandan, Munc18-1 birikimi iki saatte önemli ölçüde artmaya başladı ve dört saatte bir platoya ulaştı. Bu veriler sinaptik vezikül proteini vGlut1'in presinapslarda aktif bölge proteini Munc18-1'den daha erken biriktiğini göstermektedir.
Fmr1-KO nöronlarının presinaseslerinde Munc18-1 birikimi, Munc18-1 birikiminde FMRP'nin tutulumunu gösteren yabani tiptekilere göre 1,5 kat daha fazla arttı. Protein sentezi inhibitörü, anisomisin, hücre organları olan ve olmayan aksonlarda Munc18-1 birikimini önemli ölçüde bastırdı. Bu birikimin protein sentezine bağlı olduğunu gösterir.
Tepilmiş kortekslerin ateş cilalı ince cam Pasteur pipetkullanılarak pipetlenmesi önemli bir adımdır. Deneyciler, 2-3 farklı çapa sahip ateşcilli pipetler hazırlar ve uygun çapa sahip bir pipet seçerler. Bu prosedür kullanılarak, LRRTM2 boncuklar tarafından indüklenen presinapslardan sinaptik salınım canlı görüntüleme ile ölçülür.
Bu ek yöntem aksonlarda protein sentezinin sinaptik salınımın düzenlenmesinde rol alıp almadığı sorusuna cevap vermiştir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar presinaptik proteinlerin presinapses te nasıl biriktiğini ve presinaptik proteinlerin kaynağının yerini düzenli bir şekilde incelerler.
