该协议适用于研究前突触蛋白的来源:细胞体或轴突。以及突触形成期间，前突触蛋白如何以有组织的方式在预酶中积累。这种技术可以同时诱导数千个预收缩，并且不使用任何特殊装置来维持培养中的轴子，从而能够有效地分析轴子中许多预轴的形成。
和研究生霍纳米一起演示这个程序的将是我实验室的本科生里石井。从文本协议中描述的鼠标安乐死开始此过程。解剖腹部以获得E16胚胎。
在细尖钳的帮助下，小心地从胚胎中去除大脑，并将其转移到含有四毫升 HEPES 缓冲盐溶液或 HBSS 的 60 毫米细胞培养皿中。取出毛丝，切开嗅觉球。使用立体显微镜下钳子的细小头从每个脑半球分离皮质，并转移到另一个含有新鲜 HBSS 的 60 毫米培养皿中。
每个单独的神经元球培养使用至少三到五个胚胎。用微分弹簧剪刀在层流细胞培养罩中将皮质切成小块。现在，将切碎的皮质转移到15毫升的管子里。
在37摄氏度的水浴中，在4毫升0.125%的三辛辛中尝试4.5分钟。通过无菌转移移液器将细胞聚集转移到含有 10 毫升 HBSS 的新 15 毫升管中。在37摄氏度下孵育5分钟，然后再重复这一步。
然后将细胞聚集转移到一个新的15毫升管，其中包含两毫升的NGB培养基、0.01%的DNase I和10%的马血清。使用火抛光的精细玻璃巴斯德移液器反复上下移液三到五次，使三辛化皮质发生三到五次。为了准备神经元球，使用NGB介质将细胞悬浮液中的细胞密度调整到每毫升一百万个细胞。
在培养皿的底部加入七毫升 PBS。培养皮质神经元作为10微升悬挂滴，每滴含有10，000个细胞，在10厘米培养皿的上盖内。在37摄氏度下将盘子放在孵化器中三天，在加湿条件下使用5%的CO2，以便形成神经元球。
在 60 毫米的盘式中，使用每毫升 15 微克 PLL 溶液在玻酸盐缓冲液中将聚 L-Lysine 或 PLL 涂到石蜡珠玻璃盖上。在37摄氏度的二氧化碳培养箱中至少保留一小时。使用 PBS 洗涤四次后，将 PLL 涂层盖滑移至包含 350 微升 NGB 介质的四井板中，每个井中装有三微摩尔 AraC。
AraC 被添加到介质中以杀死分裂细胞。在 CO2 培养箱中孵育含有 PLL 涂层盖滑的四孔板至少 20 分钟，以确保介质的温度达到 37 摄氏度，然后再转移神经元球。在 DIV 3 时，当神经元球形成得非常好时，将它们转移到 PLL 涂层盖滑上。
在四井板内，每井添加五个神经元球。在DIV 11中，将20微升从悬浮物涂层磁性颗粒转移到微离心管。将珠子固定到与镉永磁体相连的手工设备上，并在 1.5 毫升微离心管中用 100 微升 PBS-MCBC 洗涤三次。
从珠子上完全去除 PBS-MCBC 后，向洗涤的珠子中加入预定体积的 LRRTM2 库存。在四摄氏度下用旋转器孵育混合物一至两个小时。孵育后，用100微升PBS-MCBC洗涤珠子两次。
然后，用100微升的NGB介质清洗珠子。将 LRRTM2 珠子重新用于 50 微升的 NGB 介质中，用于神经元球培养。现在，在立体显微镜下用剃须刀刀片以 45 度角切割黄色尖端的端部。
将黄色尖端放在神经元球的细胞体区域，然后通过吸气去除细胞体。在神经元球培养上应用 LRRTM2 和控制珠子。然后，使用铁氧体磁铁将珠子淹没到神经元球培养的板块底部一分钟，开始突触前形成。
此过程可确保同时接触所有珠子。修复和染色神经元在神经元球培养后，前突触形成与珠子，如文本协议中所述。使用 60X 油浸透镜，使用冷却的 CCD 摄像机在倒置荧光显微镜下捕捉差分干扰对比度和免疫荧光图像。
测量轴突中预突触中的免疫荧光强度。使用珠子上感兴趣区域的免疫荧光强度。减去离珠区域强度除以极光强度，沿珠子20微米。
减去背景强度。这种比率强度提供蛋白质积累指数。要量化使用LRRTM2珠子诱导的先酶的累积水平，请始终选择与细胞体分开的两个视场或更多的区域。
为了进行准确的测量，请根据盖玻片选择五个不同的斧头字段。这里展示的是LRRTM2珠子在DIV 11诱导Munc18-1在神经元球轴子预结合中神经元球培养中的应用。神经元球轴上的珠子在相位显微镜图像中可见。
免疫荧光图像观察了前突触蛋白的积累。即使在被移除的细胞体轴子中，在珠子下观察到Munc18-1的积累，类似于具有细胞体的神经元球的轴子。当通过高放大倍率目标透镜分析轴膜表的外围区域时，vGlut1和Munc18-1清楚地积聚在带细胞体和没有细胞体的珠子下的轴子预声中。
时间过程实验表明，在30分钟内，vGlut1在预分析中积累显著增加。另一方面，Munc18-1的积累在两小时后开始显著增加，并在四小时后到达高原。这些数据表明，突触囊泡蛋白vGlut1在预酶中积累得早于活性区蛋白Munc18-1。
Fmr1-KO神经元预发的Munc18-1积累比野生神经元增加1.5倍，表明FMRP参与Munc18-1积累。蛋白质合成抑制剂，非异霉素，抑制Munc18-1在轴星中显著积累，有或没有细胞体。这表明积累是蛋白质合成依赖。
使用火抛光的精细玻璃巴斯德移液器移液，是重要的一步。实验者准备了具有两到三个不同直径的火抛光移液器，并选择了直径合适的移液器。使用此过程，通过实时成像测量由 LRRTM2 珠子诱导的预囊突触释放。
这个额外的方法将回答轴突中的蛋白质合成是否参与突触释放的调节。使用这种方法，研究人员检查前突触蛋白如何以有组织的方式在预酶酶中积累，以及前突触蛋白的来源位置。
