Este protocolo é adequado para investigar de onde as proteínas pré-sinápticas se originam:corpos celulares ou axônios. E como as proteínas pré-sinápticas se acumulam em pré-anápsias de forma organizada durante a formação da sinapse. Esta técnica pode induzir milhares de pré-axinapses ao mesmo tempo, e não usa nenhum aparelho especial para manter axônios na cultura permitindo uma análise eficiente da formação de muitos pré-axinapses em axônios.
Junto com a estudante de pós-graduação, Honami, demonstrando que este procedimento será Rie Ishii, uma estudante de graduação do meu laboratório. Inicie este procedimento com eutanásia de rato conforme descrito no protocolo de texto. Dissecar o abdômen para obter embriões E16.
Remova os cérebros dos embriões cuidadosamente com a ajuda de fórceps finos, e transfira-os para pratos de cultura celular de 60 milímetros contendo quatro mililitros de solução de sal tampão HEPES ou HBSS. Remova as meninges e corte a lâmpada olfativa. Separe os cortices de cada hemisfério cerebral usando as finas pontas de fórceps sob o microscópio estéreo e transfira para outro prato de 60 milímetros contendo HBSS fresco.
Use pelo menos três a cinco embriões para cada cultura de esfera de neurônio separada. Corte os cortices em pequenos pedaços com tesouras de mola microdissectante em uma capa de cultura de célula de fluxo laminar. Agora, transfira cortices picados para um tubo de 15 mililitros.
Trypsinize os cortices picados em quatro mililitros de 0,125% trypsin no HBSS por 4,5 minutos em um banho de água a 37 graus Celsius. Transfira os agregados celulares para um novo tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de HBSS por uma pipeta de transferência estéril. Incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos antes de repetir este passo mais uma vez.
Em seguida, transfira os agregados celulares para um novo tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de ngb médio, 0,01%DNase I, e 10% de soro de cavalo. Triturar os cortices experimentpsinizados, cochilando-os repetidamente para cima e para baixo três a cinco vezes usando uma pipeta pasteur de vidro fino polida ao fogo. Para preparar bolas de neurônios, ajuste a densidade celular na suspensão celular para um milhão de células por mililitro usando meio NGB.
Adicione sete mililitros de PBS à parte inferior dos pratos da cultura. Cultura os neurônios corticais como 10 microliter gotas penduradas contendo 10.000 células por gota dentro das tampas superiores de pratos de cultura de 10 centímetros. Mantenha os pratos em uma incubadora por três dias a 37 graus Celsius com 5% de CO2 em condições umidificadas para permitir a formação de bolas de neurônios.
Cubra a poli-L-lysine ou PLL na tampa de vidro de parafina em pratos de 60 milímetros usando uma solução PLL de 15 microgramas por mililitro no tampão de borate. Mantenha-os por pelo menos uma hora em uma incubadora de CO2 a 37 graus Celsius. Depois de lavar quatro vezes com PBS, transfira os deslizamentos de cobertura revestidos de PLL para uma placa de quatro poços contendo 350 microliters de meio NGB com três AraC micromolar em cada poço.
AraC é adicionado à mídia para matar células divisórias. Incubar as placas de quatro poços contendo os deslizamentos de cobertura revestidos de PLL na incubadora de CO2 por pelo menos 20 minutos para garantir que a temperatura do meio atinja 37 graus Celsius antes de transferir as bolas de neurônios. No DIV 3, quando as bolas de neurônios forem formadas muito bem, transfira-as para deslizamentos de cobertura revestidos de PLL.
Dentro da placa de quatro poços, adicione cinco bolas de neurônio por poço. Na DIV 11 transfira 20 microliters da suspensão de partículas magnéticas revestidas de streptavidina para um tubo de microcentrifuuge. Imobilize as contas em um aparelho artesanal ligado a ímãs permanentes de neodímio e lave três vezes com 100 microlitres de PBS-MCBC em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro.
Depois de remover completamente o PBS-MCBC das contas, adicione um volume predeterminado de estoque LRRTM2 às contas lavadas. Incubar a mistura usando uma rotadora a quatro graus Celsius por uma a duas horas. Após a incubação, lave as contas duas vezes com 100 microliters de PBS-MCBC.
Em seguida, lave as contas com 100 microliters de meio NGB. Resuspende as contas LRRTM2 em 50 microliters de meio NGB para aplicação à cultura da bola de neurônio. Agora corte a ponta amarela em ângulo de 45 graus com uma lâmina de barbear sob o microscópio estéreo.
Coloque a ponta amarela na área do corpo celular de uma bola de neurônio e remova os corpos celulares por sucção. Aplique o LRRTM2 e controle as contas sobre a cultura da bola de neurônios. Em seguida, submergir as contas para o fundo das placas da cultura da bola de neurônio por um minuto usando ímãs ferrite para iniciar a formação pré-sinapse.
Este procedimento garante o touchdown de todas as contas ao mesmo tempo. Corrija e manche os neurônios na cultura da esfera do neurônio após a formação pré-sinapse com contas como descrito no protocolo de texto. Capture imagens de contraste de interferência diferencial e imunofluorescência sob um microscópio fluorescente invertido com uma câmera CCD resfriada usando uma lente de imersão de óleo de 60X.
Meça a intensidade da imunofluorescência em pré-sinapses no axônio. Use intensidades de imunofluorescência da região de interesse em contas. Menos a intensidade da região das contas fora dividida pela intensidade axonal, ao longo de 20 mícrons das contas.
Menos intensidade de fundo. Esta intensidade de razão fornece o índice de acumulação de proteínas. Para quantificar o nível de acumulação de uma determinada proteína em uma pré-insímapse induzida com contas LRRTM2, selecione sempre a área que é dois campos de visão ou mais distante do corpo celular.
Para uma medição precisa, escolha cinco campos axonais diferentes por deslizamento de cobertura. Mostrado aqui é a aplicação de contas LRRTM2 na cultura da bola de neurônio na DIV 11 induzida acumulação de Munc18-1 em presínapses de axônios de bolas neurônios. As contas em axônios de bolas de neurônios são visíveis nas imagens de microscopia de fase.
E o acúmulo de proteínas pré-sinápticas são observados pelas imagens de imunofluorescência. Mesmo em axônios que são removidos corpos celulares, o acúmulo de Munc18-1 foi observado sob as contas, semelhante aos axônios de esferas neurônios com corpos celulares. Quando a região periférica da folha axonal foi analisada por lente objetiva de alta ampliação, vGlut1 e Munc18-1 se acumularam claramente em presínapses de axônios sob as contas com e sem corpos celulares.
Experimentos de curso de tempo demonstraram que o acúmulo de vGlut1 em pré-ampares aumentou significativamente em 30 minutos. Por outro lado, o acúmulo de Munc18-1 começou a aumentar significativamente em duas horas e atingiu um patamar de quatro horas. Esses dados indicam que a proteína de vesícula sináptica vGlut1 se acumula em pré-anápsias antes da proteína da zona ativa Munc18-1.
O acúmulo de Munc18-1 em pré-aípses de neurônios Fmr1-KO aumentou 1,5 vezes mais do que os do tipo selvagem, indicando envolvimento de FMRP no acúmulo de Munc18-1. Inibidor de síntese proteica, anisomicina, suprimiu o acúmulo de Munc18-1 significativamente em axônios com e sem corpos celulares. Isso indica que o acúmulo é dependente da síntese proteica.
A pipetação dos cortices experimentpsinizados usando uma pipeta pasteur de vidro fino polida com fogo é um passo importante. Os experimentadores preparam as pipetas polidas pelo fogo com dois a três diâmetros diferentes, e escolheram uma pipeta com diâmetro apropriado. Usando este procedimento, a liberação sináptica de presínapses induzidas por contas LRRTM2 é medida por imagens vivas.
Este método adicional responderia se a síntese proteica em axônios está envolvida na regulação da liberação sináptica. Usando esse método, os pesquisadores examinam como as proteínas pré-sinápticas se acumulam em pré-aípses de forma organizada, bem como a localização da fonte de proteínas pré-sinápticas.
