Este protocolo es el resultado de evaluar aspectos clave de la preparación de la biblioteca circRNA, como el tipo de kit, el tratamiento RNase R, las cantidades de entrada y su impacto en la detección de circRNA. Permite una detección óptima de circRNA y proporciona datos sobre parámetros ajustables en función de las necesidades del usuario. Identificar los circRNAs en diferentes tipos de muestras nos ayudará a comprender mejor la distribución de su expresión y establece el escenario para delinear el papel funcional de estas moléculas.
Este método se puede aplicar a cualquier muestra total de ARN. Es importante mantener las muestras de ARN en hielo antes de comenzar el protocolo. Evalúe los valores RIN y DV200 en el Bioanalyzer Agilent o TapeStation antes de la preparación, y siga los procedimientos adecuados al trabajar con ARN.
Comience diluyendo el ARN total a cuatro microgramos en 39 microlitros de agua libre de RNase y pipeteándolo arriba y abajo para mezclar. En un tubo separado, utilice 1 tampón RNase R para diluir la RNase R a una concentración de trabajo de dos unidades por microlitro. Pipeta 39 microlitros de ARN total y cinco microlitros de 10x RNase R Reaction Buffer en un tubo de reacción de 1,5 microlitros, y mezclar.
Añadir seis microlitros de la RNase R.Then ajuste la pipeta al volumen de reacción completo, y mezcle la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Coloque el tubo en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 10 minutos, asegurándose de que todo el volumen de reacción esté sumergido en el baño de agua. A continuación, coloque el tubo sobre hielo e inmediatamente proceda con la limpieza y concentración de ARN.
Antes de empezar, prepare el tampón de lavado de ARN mezclando el concentrado con 48 mililitros de 100% etanol, y coloque las columnas de purificación en los tubos de recolección. Cuando esté listo, agregue dos volúmenes de búfer de enlace de ARN a la muestra tratada con RNase R y mezcle bien. Agregue 150 microlitros de 100% etanol a la mezcla para un total de 300 microlitros, transfiera todo el volumen a la columna y centrifugar durante 30 segundos.
Elimine el flujo a través y agregue 400 microlitros de RNA Prep Buffer directamente a la columna. Centrifugar durante 30 segundos y deseche el flujo a través. A continuación, agregue 700 microlitros de RNA Wash Buffer a la columna, centrifugar durante 30 segundos y deseche el flujo a través.
Agregue otras 400 microlitros del wash Buffer, centrifugar durante dos minutos, y transfiera la columna a un tubo fresco de 1,5 mililitros sin RNase. Agregue cuidadosamente 11 microlitros de agua libre de RNase directamente a la columna sosteniendo la punta de la pipeta justo encima del filtro de columna. Deje reposar la muestra durante un minuto a temperatura ambiente y luego centrifugarlo durante un minuto.
Asegúrese de que haya flujo a través del tubo de 1,5 mililitros y deseche la columna. La muestra de ARN purificado puede almacenarse a menos 80 grados centígrados o utilizarse inmediatamente para la preparación de la biblioteca. Transfiera 10 microlitros del ARN total purificado a un pozo limpio en una placa PCR de 96 pozos.
Añadir cinco microlitros de rRNA Binding Buffer seguidos de cinco microlitros de rRNA Removal Mix, luego pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar los reactivos. Selle la placa e ibloquela durante cinco minutos a 68 grados centígrados en un bloque termociclotro preprogramado y precalentado. Después de la incubación, deje reposar la placa a temperatura ambiente durante un minuto.
Retire el sello de la placa y agregue 35 microlitros de perlas de extracción de ARN de temperatura ambiente con vórtices a la muestra. Ajuste la pipeta a 45 microlitros, y pipetee hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces para mezclar a fondo. Deje que la placa se siente a temperatura ambiente durante un minuto.
Transfiera la placa a un soporte magnético e imagíe allí durante un minuto o hasta que la solución se despeje. Transfiera el sobrenadante a un nuevo pozo en el plato. A continuación, transfiera la placa del soporte magnético al soporte de la placa.
Cuentas de limpieza de ARN vortex hasta que estén bien dispersas, y agregue 99 microlitros de cuentas a la muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar, e incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera la placa al soporte magnético, y déjela allí durante cinco minutos o hasta que la solución se aclare, luego retire y deseche todo el sobrenadante del pozo.
Con la placa todavía en el soporte magnético, añadir 200 microlitros de 80% etanol recién preparado al pozo sin interrumpir las perlas. Deje el etanol en el pozo durante 30 segundos, luego retírelo y deséchelo. Agregue 11 microlitros de Elution Buffer al pozo, y pipetearlo arriba y abajo para mezclar.
Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos minutos, luego transferirla de vuelta al soporte magnético, y mantenerla allí hasta que la solución se despeje. Transfiera 8,5 microlitros del sobrenadante a un nuevo pozo en la misma placa, y agregue 8,5 microlitros de Elute, Primer, Fragment High Mix a cada pozo que contenga una muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar bien, sellar la placa e incubar durante ocho minutos en un termociclador precalentado a 94 grados centígrados.
Enfríe la muestra a cuatro grados centígrados, retire la placa del termociclo y centrifugar brevemente. Se evaluaron dos kits de preparación de bibliotecas, TruSeq y KAPA, para este protocolo. En general, se detectó un mayor número de ARN circulares y un menor porcentaje de ARN ribosomal cuando se utiliza el kit TruSeq, por lo que TruSeq fue seleccionado para otros experimentos.
La importancia del pretratamiento de RNase R se evaluó comparando los datos generados a partir de bibliotecas pretratadas y no pretratadas. Como era de esperar, se identificó sistemáticamente un mayor número de ARN circulares en las bibliotecas pretratadas en comparación con las no pretratadas. La cantidad de ARN de entrada se optimizó para detectar una mayor diversidad de ARN circulares.
Las bibliotecas se prepararon utilizando uno, dos y cuatro microgramos de ARN de entrada, y se observó la mayor diversidad de especies de ARN circular cuando se utilizaban cuatro microgramos de ARN total. El protocolo optimizado se utilizó para comparar las abundancias circulares de ARN en cinco regiones cerebrales de cuatro donantes sanos y para otros tipos de tejidos de seis donantes sanos. En general, se observó una mayor abundancia de ARNa circular en el cerebro en comparación con otros tipos de tejido.
Es importante recordar seguir los procedimientos apropiados cuando se trabaja con ARN, incluyendo el uso de guantes, limpiar a fondo el banco y las pipetas con toallitas RNase o aerosol antes de comenzar el protocolo, y mantener el ARN en hielo de antemano. Después de este procedimiento, se puede realizar la validación ortogonal como la secuenciación de Sanger de cruces de circRNA identificados. El descubrimiento de nuevos circRNAs y más evidencia de su presencia tallan una nueva área de investigación para explorar sus funciones biológicas.
