该协议是评估圆RNA库制备的关键方面的结果，如试剂盒类型、RNase R治疗、输入量及其对圆环RNA检测的影响。它可实现最佳的圆环RNA检测，并根据用户的需求提供有关可调参数的数据。识别不同样本类型的圆环RNA将有助于我们更好地了解其表达的分布，并设置这些分子的功能作用。
此方法可应用于任何总RNA样本。在开始协议之前，将RNA样本放在冰上是重要的。在准备前评估安捷伦生物分析器或磁带站上的 RIN 和 DV200 值，并在使用 RNA 时遵循适当的步骤。
首先在39微升无RNase水中将总RNA稀释至4微克，然后上下移液混合。在单独的管中，使用 1x RNase R 缓冲液将 RNase R 稀释到每微升两个单位的工作浓度。将总RNA的39微升和5个微升的10xRNase R反应缓冲液放入1.5微升反应管中，并混合。
加入稀释的 RNase R.的六微升，然后将移液器调整为全反应量，然后通过上下移液 10 次混合溶液。将管子放在37摄氏度的水浴中10分钟，确保将全部反应量浸入水浴中。然后，将管子放在冰上，并立即进行RNA清理和浓缩。
在开始之前，准备RNA洗涤缓冲液，将浓缩液与48毫升100%乙醇混合，并放入收集管中。准备就绪后，将两卷RNA结合缓冲液添加到RNase R处理样品中，并很好地混合。在混合物中加入150微升100%乙醇，共300微升，将整个体积转移到柱子上，并离心机30秒。
去除流，并将400微升RNA准备缓冲液直接添加到柱子中。离心30秒，然后丢弃流经。然后，将700微升RNA洗涤缓冲液加入柱，离心机30秒，然后丢弃流经。
再添加 400 微升的洗涤缓冲器，离心机两分钟，并将柱转移到新的无 RNase 1.5 毫升管中。将移液器尖端在柱过滤器正上方，小心地将 11 微升无 RNase 水直接添加到柱中。让样品在室温下坐一分钟，然后离心一分钟。
确保 1.5 毫升管中有流量，然后丢弃柱。纯化的RNA样品可以储存在零下80摄氏度，或立即用于库准备。将纯化总RNA的10微升转移到96井PCR板中的清洁井中。
加入五微升的 rRNA 结合缓冲液，然后加入五升 rRNA 去除混合微升，然后轻轻上下移液器混合试剂。密封板，并在68摄氏度的高温下在预编程和预热热循环器块上孵育5分钟。孵育后，让板在室温下坐一分钟。
从板上取下密封件，并将 35 微升涡旋室温 rRNA 去除珠添加到样品中。将移液器调整为 45 微升，上下移液器 10 至 20 次以彻底混合。让板在室温下坐一分钟。
将板转移到磁性支架上，在那里孵育一分钟或直到溶液清除。将上一液转移到板上的新井。然后将板从磁性支架转移到板支架上。
涡流RNA清理珠子，直到它们被很好地分散，并添加99微升珠到样品。上下移液混合，在室温下孵育板10分钟。将板转移到磁性支架上，并在那里保留五分钟，或直到溶液清除，然后从井中清除并丢弃所有上清液。
当板还在磁支架上时，在井中加入200微升新鲜准备好的80%乙醇，而不会打乱珠子。将乙醇留在井中30秒，然后取出并丢弃。向井中加入 11 微升的洗脱缓冲液，然后上下移液混合。
在室温下孵育板两分钟，然后将其转移回磁性支架，并一直放在该板，直到溶液清除。将 8.5 微升的上一液转移到同一板上的新井中，并将 8.5 微升的 Elute、Primer、碎片高混合添加到每个包含样品的井中。上下移液10次，以彻底混合，密封板，并在热循环器预热至94摄氏度中孵育8分钟。
将样品冷却至4摄氏度，从热循环器中取出板，并短暂离心。为该协议评估了两个图书馆准备工具包，TruSeq和KAKA。总体而言，使用TruSeq试剂盒时检测到的圆形RNA数量和核糖核糖核RNA百分比较低，因此选择TruSeq进行进一步实验。
通过比较预处理和非预处理库生成的数据，评估了 RNase R 预处理的重要性。正如预期的那样，与未预处理的库相比，在预处理库中始终识别着数量较高的循环RNA。输入RNA的量经过优化，可检测循环RNA的更高多样性。
库使用1、2和4微克输入RNA，使用4微克总RNA时观察到循环RNA物种的最高多样性。优化方案用于比较来自四个健康捐赠者的五个大脑区域的循环RNA丰度，以及来自六个健康捐赠者的其他组织类型。总的来说，与其他组织类型相比，大脑中观察到的圆形RNase的丰度更高。
在开始协议之前，在使用 RNA 时，必须记住遵循适当的程序，包括戴手套、用 RNase 湿巾彻底清洁长凳和移液器或喷雾器，以及事先将 RNA 放在冰上。按照这个程序，可以执行正交验证，如桑格测序识别的圆RNA结。新的环RNA的发现和它们存在的进一步证据开辟了探索其生物功能的新研究领域。
