Lenfosit transmigration herhangi bir bağışıklık yanıtı önemli bir özelliğidir. Bu nedenle, bir araştırmacı iyi tanımlanmış bir in vitro sistemde lenfositlerin hareketliliğini değerlendirmek için izin verir, çünkü bu protokol önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı çeşitli kemokinler son tanımlanan hücrelerde göç indükleyen etkinliğini belirlemek için değerlendirilebilir, grup iki doğuştan lenfoid hücreler gibi, veya ILC2.
İkinci bir avantajı inhibitörleri veya belirli kemokin yollarını engellemeamaçlı biyolojik tedaviler hayvanlarla daha pahalı deneyler yapmadan önce bu yöntemle test edilebilir olmasıdır. Grup başına iki ila üç hayvan kullanarak ötenazi ova-tedavi erkek ve dişi fareler den akciğerler ve dalak çıkarma ile başlayın. Doku tipine ve hayvan cinsiyetine göre ayrı ayrışma tüplerine eksise edilmiş dokuları yerleştirin.
Akciğer dokusunu 500 mikrolitre akciğer ayrıştırma ortamına yerleştirin, tüpü otomatik doku ayrıştırıcıya yerleştirin ve akciğer protokolünü kullanarak ayrıştırın. Bu adımları toplam iki kez tekrarlayın. Dalak dokusunu ayrıştırmak için, ayrıştırıcıda 500 mikrolitre tam RPMI media yerleştirin ve sonra dalak protokolünü kullanın.
Bundan böyle steril bir teknik kullanarak biyolojik bir güvenlik kabininde çalışarak, ayrıştırığı her dokuyu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin ve 50 mililitrelik konik tüpler halinde toplayın. Akciğer homojeni içeren dissosiasyon tüplerini beş mililitre ek akciğer dissociation media, dalak homojeni içeren tüpleri beş mililitre tam RPMI ile durulayın ve içeriklerini ilgili dokular için kullanılan filtreleraracılığıyla filtreleyin. Akciğer dokusunu daha da ayrıştırmak için, %5 karbondioksit içeren 37 derecelik bir kantinde 15-30 dakika kuluçkaya yatırılır.
Sonra akciğer ve dalak homojenler hem de tam RPMI beş mililitre ekleyin ve santrifüj. Supernatant attıktan sonra, tek bir 50 mililitrelik konik tüp içine aynı cinsiyetten hayvanların grubundan splenositler ve akciğer hücreleri içeren pelet birleştirir. Her tüpe 10 mililitre tam RPMI ekleyin ve yeniden askıya alın.
Otomatik bir hücre sayacı kullanarak toplam hücre sayısını belirleyin. Ayırma tamponunda mililitre başına 100 milyon hücreye erkek ve kadın hücre süspansiyonlarını ayarlayın ve ardından beş mililitrelik polistiren tüpe ekleyin. El yazmasında açıklandığı gibi toplam hücrelerin 2/3'ünden grup iki doğuştan gelen lenfoid hücreyi izole ettikten sonra, CD4-pozitif T hücre izolasyonu işlemi için kalan hücreleri kullanın.
CD4-pozitif T hücre izolasyonuna başlamak için, CD4 T hücre zenginleştirme süspansiyonuna sıçan serumu ekleyin. Daha sonra hücre örneğine izolasyon kokteyli ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatın. Girdap hızlı küreler için 30 saniye, ve mililitre başına 75 mikrolitre bir seyreltme elde etmek için hücre örneğine ekleyin.
Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 21/2 dakika kuluçkaya yatırın. Üç mililitreye kadar yaklaşık iki mililitre ayırma tamponu ile örneklerin üst kısmında, beş mililitrelik tüpleri sekiz odalı kolay ayırma mıknatısına yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Sonra mıknatısı öne doğru çevirin ve her hücresüspansiyonlu pipeti temiz bir beş mililitrelik tüpe dönüştürün.
Her tüpe 1,5 mililitre serumsuz RPMI ve santrifüj ekleyin. Supernatant dökün ve serum içermeyen RPMI mililitre başına 10 milyon hücrede CD4-pozitif T hücre pelet yeniden askıya. Protokolün bu bölümüne başlamak için, makalede açıklandığı gibi hem ILC2 hem de CD4-pozitif T hücreleri için deneme için gereken Transwell uçlarının sayısını belirleyin.
Üç mikronluk Transwell'i 24 kuyulu bir plakanın orta sıralarından pipet ucu ve eldivenli ellerle aynı 24 kuyulu plakanın üst ve alt sıralarına hafifçe hareket ettirin. 24 kuyulu plakanın orta sırasındaki kuyuların 1/3'üne CCL17 ile 500 mikrolitre göç ortamı ekleyin. Kuyuların 1/3'üne CCL22 ile 500 mikrolitre geçiş ortamı ekleyin.
Ve son olarak, kuyuların son 1/3'üne kemokin içermeyen 500 mikrolitre serumsuz RPMI ekleyin. Plakaüzerindeki kapağı, alt kuyulara yerleştirilen uygun transmigration ortamının adı ile net bir şekilde etiketlayın. Daha sonra Transwell'i çeşitli tedavileriçeren kuyulara geri yerleştirin.
Transwells'te hücre süspansiyonunun yukarı ve aşağı karıştırılmamasını veya pipetleilmemesini sağlayarak, her kesici uçtaki üst kuyuya 100 mikrolitre CD4 T hücresi veya ILC2 ekleyin. Plakaüzerindeki kapağı her kuyuya yerleştirilen hücre tipiyle net bir şekilde etiketlayın ve hücrelerin eklendiğinin tarih ve saatini yazın. Transwell kesici uçlardan tüm hücreler transwell kesici uçlara ortam la yerleştirilene kadar bu işlemi plakadan çıkararak tekrarlayın.
İlgi hücreleri izole olduktan sonra, en önemli adımlar kemokinler ve özellikle kuyulara yerleştirilir hücre tipleri takip etmek, yavaşça üst odalarına hücreleri eklemek için, ve son olarak 48 saatlik kuluçka sırasında transmigration plaka ile gereksiz temas önlemek için. Plakayı %5 karbondioksit içeren 37 derecelik bir kantine yavaşça yerleştirin ve kuluçka süresi boyunca plakayla teması en aza indirmek için 48 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı kuvözden hafifçe çıkardıktan sonra, orta sıralardan tüm Transwell kesici uçlarını hemen üstündeki veya altındaki boş kuyulara çıkarın.
Transwell eklerüst ve alt kuyularından CCL17, CCL22 veya medya ile üst veya alt etiketli tüpler içine hücreleri toplamak, hücre türü ile, ve çoğaltma numarası ile. 1x PBS 500 mikrolitre ile alt kuyuları durulayın, ilgili tüpler içine toplamak ve üst kuyular için aynı şeyi. Tüpleri oda sıcaklığında 378 kez 5 dakika santrifüj edin.
Tüm supernatant'ı nazikçe çıkarmak ve ardından 50 mikrolitre 1x PBS ile T hücresini ve ILC2 peletlerini yeniden askıya almak için bir pipet kullanın. Hücre süspansiyon10 mikrolitre çıkardıktan sonra, 0.4% trypan mavi 90 mikrolitre ekleyin. Otomatik hücre sayacındaki hücreleri say.
Ve her örnek için, mililitre başına canlılık ve hücre sayısı nın rekor yüzdesi, ve üst ve alt odasında tedavi başına hücre toplam sayısını belirlemek. CCR4 ekspresyonu hem CD4-pozitif T hücrelerinde hem de ILC2'de akış sitometrisi ile değerlendirildiğinde, erkek ve kadın konaklar arasında fark yoktu. Ancak, ILC2'de hücre başına CCR4 ifadesi CD4-pozitif T hücrelerine göre daha yüksekti.
Transwell cihazının alt odası işlenmemiş hücre kültürü ortamı, CCL22 içeren ortam veya CCL17 içeren ortamlarla doldurulduğunda, hücrelerin %14'ünden azı medya kontrol koşullarında göç etti. CCL22'ye yanıt olarak, her iki hücre tipi, ister erkek ister kadın konaklardan olsun, CCL22'ye yanıt verdi. Ayrıca, CCL22 erkek ILC2 CCL17 daha büyük göç indüklenen.
Öte yandan, CCL17 kadın CD4 T hücreleri ve ILC2 medya tek başına göre önemli göç indüklenen. CCL17 tedavisi erkek CD4-pozitif T hücreleri veya erkek ILC2 için ortam farklı değildi. Optimal olmayan koşullarda, CD4 hücreleri olan plaka ilk 24 saat oda sıcaklığında kaldığında ve daha sonra kuvöze taşındığında, CCL22 ve CCL17'ye doğru herhangi bir göç olmadı.
Ayrıca, hücrelerin canlılığı özellikle alt odadaki hücreler için düşüktü ve bu protokolde açıklanan doğru sıcaklık ve koşulları nen iyi sonuçları elde etmek için kullanmanın önemini gösteriyordu. Transmigration prosedürü tamamlandıktan sonra, medya kontrol kuyuları ile karşılaştırıldığında ilgi chemokine önemli göç görmek gerekir. Önemli bir göç görülmezse, işlemin düzgün çalışmadığı veya lenfositlerin söz konusu kemokine yanıt vermediğini varsayabiliriz.
Bu lenfositler in vivo tedavilerin geniş bir yelpazede uğramıştır zaman bu teknik lenfosit göç anlamak için geniş kullanılabilir.
