يسمح هذا البروتوكول بإنتاج أطراف هابلويد مُتَمَحَّة يمكن استخدامها في الفحص الجيني في الفأسولوتيل. في haploids، حتى الطفرات منخفضة المستوى يمكن أن تنتج فقدان الأنماط الظاهرية وظيفة داخل الخلايا. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية التطعيم لإنقاذ الأنماط الظاهرية القاتلة الجنينية.
يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة التجدد في أي نوع من البرمائيات التي هي قابلة للتخصيب في المختبر والتطعيم. قبل استخدام أجنة الهابلويد كمتبرعين، نوصي بممارسة وتأكيد نجاح الطعوم بين الأجنة الموجبة والسالبية من GFP. لإعداد الإناث المتبرعين، تخدير ناضجة جنسيا الأبيض أو الأبيض RFP الإناث axolotl لتكون بمثابة المانح gamete.
بعد التأكد من عدم وجود استجابة لمحاكاة الألم ، استخدم حقنة الأنسولين 30 لقياس لحقن 0.15 ملليلتر من gonadotropin المشيمية البشرية في الظهر العضلي إلى الطرف الخلفي. أدخل الحقنة بزاوية 45 درجة إلى خط الوسط لتجنب ملامسة الحبل الشوكي. وضع الحيوان المحقون في حل 40٪ Holtfreter الطازجة ونقل axolotl إلى ثلاجة درجة مئوية من ثمانية إلى 12 لمدة 48 ساعة.
ثم ارجع الأنثى إلى درجة حرارة الغرفة. في حين أن الأنثى تضع البيض ، ضع ذكرًا مُهدّدًا بالكامل في موضع الوبيب على مناشف ورقية رطبة تحت مجهر تشريح ووضع طرف ماصة P1000 في قاعدة كلواكا مع اليد المهيمنة. ضع السبابة الأخرى والإبهام من اثنين إلى ثلاثة سنتيمترات من الجرندر إلى الحوض والضغط بلطف على الحيوان أثناء تحريك الأصابع نحو الساقين الخلفيتين لطرد عينات البول المنوية التي تجمع كل عينة في أنبوب جديد للريف الدقيق.
ثم نقل خمسة ميكرولترات من كل عينة إلى طبق بيتري لفحص نوعية الحيوانات المنوية باستخدام مجهر مقلوب. بعد العد، وتمييع الحيوانات المنوية إلى تركيز ثماني مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر في 0.1X MMR العقيمة ونقل 0.5 ميكرولترات من خلايا الحيوانات المنوية لكل بويضة إلى طبق بيتري جديد. ثم استخدم طرف الماصات لنشر التعليق إلى طبقة سميكة ملليمتر واحد واستخدام رفع البلاستيك لوضع عينة أربعة سنتيمترات من المصابيح من 254 نانومتر crosslinker للإشعاع في ثماني مرات 10 إلى الجزئيات الخامسة لكل ملليمتر مربع.
بعد جمع عينة الحيوانات المنوية صحية، وضع الأنثى في موقف supine على كومة من المناشف الورقية الرطبة واستخدام حركة التنظيف مماثلة لاستخراج البيض غير المخصب من axolotl الإناث. ثم استخدام ملقط الرطب لنقل البيض في طبق بيتري 10 سم. في غضون 15 دقيقة من جمع، واستخدام ماصة P10 لصرف الحيوانات المنوية المشعة على البويضات غير المخصبة طلاء كل بيضة مع 0.25 إلى 0.5 ميكرولترات من الحيوانات المنوية المعطلة.
بعد السماح للبيض بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، غمر البيض بـ 0.1X MMR. بعد ثلاثين دقيقة من الترطيب ، استخدم ملقطًا حادًا لتخريد البيض ووضع البيض عند درجة 18 درجة مئوية للانصاب الدقيق في غضون سبع ساعات. لتوليد chimera haploid-diploid، وضع متبرع واحد صحي haploid مع مرحلة واحدة أو اثنتين مطابقة GFP الأجنة المضيفة إيجابية diploid داخل الحوض الصغير لطبق التشغيل قبل المبردة التي تحتوي على المتوسطة الجراحية على 10 درجة مئوية أو أقل مرحلة التبريد.
استخدام اثنين من autoclaved غرامة جدا ملقط تلميح مستقيم لإزالة برعم الأطراف بأكملها و ectoderm المحيطة طبقات الأنسجة وميسوديرم وتوضع جانبا الأنسجة المضيفة. إزالة اغدغ الأنسجة ذات الحجم المكافئ من المتبرع haploid ووضع هابلويد المانحة معجد الأنسجة على المنطقة المقابلة من الجنين المضيف. تأمين الأنسجة مع قطع الزجاج مستطيلة autoclaved من غطاء المجهر سحقت واضغط بلطف الأنسجة في الجسم الجنين المضيف.
اترك المرساة في مكانها لمدة 60 إلى 75 دقيقة للتحقق من كل 20 دقيقة للتأكد من أن الزجاج لم ينزلق قبل استخدام ملقط لتقشير جزء الغطاء الزجاجي. نقل الأجنة المنقوشة إلى المتوسطة الجراحية الطازجة مما يسمح لهم بالشفاء في 8 إلى 12 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل إسكان الأجنة المنقوشة بشكل فردي في 12 أو 24 لوحة بئر. 38.7٪ من البويضات المتقدمة إلى الأجنة هابلويد وضعت عادة.
في مرحلة الكسب غير المشروع ، تظهر أجنة haploid انحناءًا مخفضًا على طول المحور الأمامي الأمامي وضميمة غير مكتملة لسد الصفار. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام المجهر الفلوري لتأكيد أجنة haploid خالية من تعبير GFP المستمدة من الأبوة. الطعوم الفاشلة والناجسة تنتج مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية.
عندما تكون الطعوم نظيفة وعادة ما تكون متطورة، يجب أن يقتصر التعبير GFP في المقام الأول على الضفيرة العضدية، والشبكة العصبية المستمدة من الحبل الشوكي المضيف. التعبير عن GFP punctate موجود أيضا في الخلايا الفردية التي يبدو أن الخلايا العصبية الحسية في خلايا المضيفة المستمدة من الدم التي تهاجر إلى الطرف النامية. عندما يتم استخدام المتبرعين الإيجابيين RFP، تظهر أطراف الكسب غير المشروع الهابلويد تعبيرًا عالميًا عن RFP.
طوال التنمية ، تكون أطراف haploid غير المُمَاجَنة أقصر بكثير من المُقَدَّمة diploid المتعارضة في الشيميك. تتجدد أطراف الدم الحميد غير المُؤجَّرة تمامًا ، على الرغم من أنها تظهر تأخيرًا طفيفًا في الوصول إلى مرحلة النمو الرقمي مقارنة بالدبلويدات. تذكر استخدام تقنية معقمة وإزالة تماما واستبدال كامل الطبقات الأنسجة ال ميديرم و ectoderm من المضيف الجنيني من أجل إنتاج طرف المطعمة نظيفة.
يمكن بتر الأطراف المتحولة وحصدها للنمط الظاهري للتجدد. يمكن قياس آليل متحولة مع تسلسل الجيل القادم. جنبا إلى جنب مع كريسبر-Cas9 mutagenesis، وقد سمح لنا تقنية التطعيم لدينا لإجراء شاشة اختيار سلبية من الجينات المستهدفة في تجديد أطرافها haploid.
