Dieses Protokoll ermöglicht die Produktion von mutagenisierten haploiden Gliedmaßen, die für das genetische Screening im Axolotl verwendet werden können. Bei Haploiden kann selbst eine niedere Mutagenese den Verlust von Funktionsphänotypen innerhalb von Zellen verursachen. Diese Transplantationstechnik kann auch zur Rettung embryonaler tödlicher Phänotypen eingesetzt werden.
Diese Methode kann verwendet werden, um die Regeneration bei allen Amphibienarten zu untersuchen, die für In-vitro-Fertilisation und Transplantation geeignet sind. Bevor wir haploide Embryonen als Spender verwenden, empfehlen wir, den Erfolg von Transplantaten zwischen GFP-positiven und negativen diploiden Embryonen zu praktizieren und zu bestätigen. Für die Vorbereitung weiblicher Gamete-Spender, anästhesieren Sie ein geschlechtsreifes weißes oder weißes RFP-Weibchen-Axolotl, um als Gamete-Spender zu dienen.
Nachdem Sie einen Mangel an Reaktion auf Schmerzsimulation bestätigt haben, verwenden Sie eine 30 Gauge Insulinspritze, um 0,15 Milliliter humanes Choriongonadotropin in die Muskulatur dorsal in die Hinterbeinige zu injizieren. Setzen Sie die Spritze in einem 45-Grad-Winkel zur Mittellinie ein, um den Kontakt mit dem Rückenmark zu vermeiden. Das injizierte Tier in eine frische 40%Holtfreter-Lösung geben und das Axolotl 48 Stunden lang in einen acht bis zwölf Grad Celsius Kühlschrank geben.
Dann kehren Sie das Weibchen auf Raumtemperatur zurück. Während das Weibchen Eier legt, legen Sie ein voll beseelisiertes Männchen in die Rückenlage auf feuchte Papiertücher unter einem Sezierendes Mikroskop und positionieren Sie die Spitze einer P1000 Pipette an der Basis der Kloake mit der dominanten Hand. Legen Sie den anderen Zeigefinger und Daumen zwei bis drei Zentimeter rostral in das Becken und drücken Sie das Tier sanft, während Sie die Finger in Richtung der Hinterbeine bewegen, um die Spermien-Urinproben, die jede Probe sammeln, in ein neues Mikrozentrifugenrohr zu spülen.
Dann übertragen Sie fünf Mikroliter aus jeder Probe in eine Petrischale, um die Qualität des Spermas mit einem invertierten Mikroskop zu überprüfen. Nach dem Zählen das Sperma auf eine Konzentration von acht mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Milliliter in 0,1X sterilem MMR verdünnen und 0,5 Mikroliter Spermien pro Ei in eine neue Petrischale übertragen. Dann verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Suspension auf eine ein Millimeter dicke Schicht zu verteilen und die Probe mit einem Kunststofflift vier Zentimeter von den Glühbirnen eines 254 Nanometer-Verknüppels für die Bestrahlung bei achtmal 10 bis fünf Mikrojoule pro Millimeter quadratisch zu platzieren.
Nach dem Sammeln einer gesunden Spermienprobe, legen Sie das Weibchen in der Supine-Position auf einen Stapel von feuchten Papiertüchern und verwenden Sie eine ähnliche Spülbewegung, um unbefruchtete Eier aus dem weiblichen Axolotl zu extrahieren. Dann verwenden Sie nasse Zange, um die Eier in eine 10 Zentimeter Petrischale zu übertragen. Verwenden Sie innerhalb von 15 Minuten nach der Entnahme eine P10-Pipette, um das bestrahlte Sperma auf die unbefruchteten Eier zu verteilen, die jedes Ei mit 0,25 bis 0,5 Mikroliter inaktivierten Spermien beschichten.
Nachdem Sie die Eier 30 Minuten bei Raumtemperatur sitzen lassen, überfluten Sie die Eier mit 0,1X MMR. Dreißig Minuten nach der Hydratation, verwenden Scharfe Zange, um die Eier zu entjelly und legen Sie die Eier bei 18 Grad Celsius für Mikroinjektion innerhalb von sieben Stunden. Um eine haploid-diploide Chimäre zu erzeugen, platzieren Sie einen gesunden haploiden Spender mit einem oder zwei Stufen abgestimmten GFP-positiven diploiden Wirtsembryonen in den Trog einer vorgekühlten Operationsschale, die chirurgisches Medium auf einem 10 Grad Celsius oder niedrigeren Kühlstadium enthält.
Verwenden Sie zwei ultrafeine autoklavierte gerade Spitzenzange, um die gesamte Gliedmaßenknospe und die umgebenden Ektoderm- und Mesodermgewebeschichten zu entfernen und das Wirtsgewebe beiseite zu legen. Entfernen Sie eine gleichwertig große Gewebescheide vom haploiden Spender und legen Sie die haploide Spendergewebescheide auf den entsprechenden Bereich des Wirtsembryons. Sichern Sie das Gewebe mit einer autoklavierten rechteckigen Glasscherbe aus einem zerkleinerten Mikroskop-Coverglas und drücken Sie das Gewebe vorsichtig in den Körper des Wirtsembryons.
Lassen Sie den Anker für 60 bis 75 Minuten an Ort und Stelle, um alle 20 Minuten zu überprüfen, ob das Glas nicht gerutscht ist, bevor Sie die Zange verwenden, um das Deckglasfragment abzublättern. Übertragen Sie die transplantierten Embryonen in ein frisches chirurgisches Medium, so dass sie über Nacht bei acht bis 12 Grad Celsius heilen können, bevor sie die transplantierten Embryonen einzeln in 12 oder 24-Well-Platten beherbergen. 38,7 % der Eizellen entwickelten sich zu normal entwickelten haploiden Embryonen.
Im Transplantatstadium weisen haploide Embryonen eine reduzierte Krümmung entlang der vorderen-hinteren Achse und ein unvollständiges Gehäuse des Dottersteckers auf. Darüber hinaus kann ein Fluoreszenzmikroskop verwendet werden, um zu bestätigen, dass die haploiden Embryonen frei von väterlicher GFP-Expression sind. Gescheiterte und unreine Transplantate produzieren eine Vielzahl von Phänotypen.
Wenn die Transplantate sauber und normal entwickelt sind, sollte die GFP-Expression in erster Linie auf den Brachialplexus beschränkt werden, das neuronale Netzwerk, das vom Wirtsrückenmark abgeleitet wird. Punctate GFP-Expression ist auch in einzelnen Zellen vorhanden, die sensorische Neuronen in blutabgeleiteten Wirtszellen zu sein scheinen, die in die sich entwickelnde Gliedmaße wandern. Wenn RFP-positive Spender verwendet werden, weisen haploide Transplantat-Glieder einen universellen Ausdruck von RFP auf.
Während der gesamten Entwicklung sind nicht-mutagenisierte haploide Gliedmaßen deutlich kürzer als die gegnerischen diploiden Vorderbeine bei chimarischem Tier. Nicht-mutagenisierte haploide Gliedmaßen regenerieren sich vollständig, obwohl sie eine leichte Verzögerung beim Erreichen des digitalen Auswuchsstadiums im Vergleich zu Diploiden zeigen. Denken Sie daran, sterile Technik zu verwenden und vollständig entfernen und ersetzen Sie die vollen Mesoderm und Ektoderm Gewebeschichten aus dem embryonalen Wirt, um eine sauber transplantierte Gliedmaße zu produzieren.
Mutante Gliedmaßen können amputiert und für Regenerations-Phänotypen bewertet werden. Mutante Allele können mit der Sequenzierung der nächsten Generation quantifiziert werden. In Kombination mit CRISPR-Cas9 Mutagenese hat unsere Pfropftechnik es uns ermöglicht, einen negativen Selektionsschirm von gezielten Genen bei der Regeneration haploider Gliedmaßen durchzuführen.
