Este protocolo permite la producción de extremidades haploides mutagenizadas que se pueden utilizar para el cribado genético en el axolotl. En los haploides, incluso la mutagénesis de bajo nivel puede producir pérdida de fenotipos de función dentro de las células. Esta técnica de injerto también se puede utilizar para rescatar fenotipos letales embrionarios.
Este método se puede utilizar para estudiar la regeneración en cualquier especie de anfibio que sea susceptible de fertilización in vitro e injerto. Antes de utilizar embriones haploide como donantes, recomendamos practicar y confirmar el éxito de los injertos entre embriones diploide positivos de la GFP y los embriones diploides negativos. Para la preparación de donantes de gametos femeninos, anestesia una a axolotl hembra RFP blanca o blanca sexualmente madura para que sirva como donante de gametos.
Después de confirmar una falta de respuesta a la simulación del dolor, utilice una jeringa de insulina de calibre 30 para inyectar 0,15 mililitros de gonadotropina coriónica humana en la musculatura dorsal a la extremidad posterior. Inserte la jeringa en un ángulo de 45 grados en la línea media para evitar el contacto con la médula espinal. Coloque el animal inyectado en una solución fresca de 40%Holtfreter y transfiera el axolotl a un refrigerador de ocho a 12 grados Celsius durante 48 horas.
A continuación, vuelva a la hembra a temperatura ambiente. Mientras la hembra pone huevos, coloque a un macho completamente anestesiado en la posición supina sobre toallas de papel húmedas bajo un microscopio diseccionado y coloque la punta de una pipeta P1000 en la base de la cloaca con la mano dominante. Coloque el otro dedo índice y el pulgar de dos a tres centímetros rosados a la pelvis y apriete suavemente al animal mientras mueve los dedos hacia las patas traseras para eliminar las muestras de orina espermáticas que recogen cada muestra en un nuevo tubo de microcentrífuga.
Luego transfiera cinco microlitros de cada muestra a una placa Petri para inspeccionar la calidad de los espermatozoides usando un microscopio invertido. Después de contar, diluir el espermatozoide a una concentración de ocho veces 10 a las cuartas células por mililitro en MMR estéril 0.1X y transferir 0,5 microlitros de espermatozoides por óvulo a un nuevo plato de Petri. A continuación, utilice la punta de la pipeta para extender la suspensión a una capa de un milímetro de espesor y utilice un elevador de plástico para colocar la muestra a cuatro centímetros de las bombillas de un reticulador de 254 nanómetros para irradiación a ocho veces 10 a la quinta microjulios por milímetro cuadrado.
Después de recoger una muestra de espermatozoides saludable, coloque la hembra en la posición supina en una pila de toallas de papel húmedas y use un movimiento de lavado similar para extraer óvulos no fecables del axolotl hembra. Luego usa fórceps húmedos para transferir los huevos a un plato de Petri de 10 centímetros. Dentro de los 15 minutos de la recolección, utilice una pipeta P10 para dispensar el esperma irradiado en los óvulos no fecados que recubren cada óvulo con 0,25 a 0,5 microlitros de espermatozoides inactivados.
Después de permitir que los huevos se sienten a temperatura ambiente durante 30 minutos, inunde los huevos con 0.1X MMR. Treinta minutos después de la hidratación, use fórceps afilados para dejar de los huevos y coloque los huevos a 18 grados Celsius para la microinyección dentro de siete horas. Para generar una quimera haploide-diploide, coloque un donante haploides sano con uno o dos embriones de host diploide positivoS de GFP emparejados dentro de la vaguada de un plato de operación pre-enfriado que contenga un medio quirúrgico en una etapa de enfriamiento de 10 grados Celsius o menor.
Utilice dos fórceps rectos autoclaves ultra finos para extraer toda la yema de la extremidad y las capas circundantes de tejido de ectodermo y mesodermo y deje a un lado el tejido huésped. Retire una vaina de tejido de tamaño equivalente del donante de haploide y coloque la vaina de tejido del donante haploide en la región correspondiente del embrión huésped. Asegure el tejido con un fragmento de vidrio rectangular autoclavizado de un vidrio de cubierta de microscopio triturado y presione suavemente el tejido en el cuerpo del embrión huésped.
Deje el anclaje en su lugar durante 60 a 75 minutos comprobando cada 20 minutos para confirmar que el vidrio no se ha deslizado antes de usar los fórceps para despegar el fragmento de la cubierta. Transfiera los embriones injertados a un medio quirúrgico fresco, lo que les permite sanar a ocho a 12 grados centígrados durante la noche antes de albergar los embriones injertados individualmente en placas de 12 o 24 pozos. El 38,7% de los ovocitos se convirtieron en embriones haploide normalmente desarrollados.
En la etapa del injerto, los embriones haploide presentan una curvatura reducida a lo largo del eje anterior-posterior y un recinto incompleto del tapón de la yema. Además, se puede utilizar un microscopio fluorescente para confirmar que los embriones haploide están libres de expresión de GFP derivada paternally. Los injertos fallidos e impuros producen una variedad de fenotipos.
Cuando los injertos están limpios y normalmente desarrollados, la expresión de GFP debe limitarse principalmente al plexo braquial, la red neuronal derivada de la médula espinal del huésped. La expresión punctato de LA GFP también está presente en células individuales que parecen ser neuronas sensoriales en las células huésped derivadas de la sangre que migran a la extremidad en desarrollo. Cuando se utilizan donantes positivos de RFP, las extremidades del injerto de haploide exhiben una expresión universal de RFP.
A lo largo del desarrollo, las extremidades haploides no mutagenizadas son significativamente más cortas que las extremidades anteriores del diploide opuestos en animales quiméricos. Las extremidades haploides no mutagenizadas se regeneran por completo, aunque demuestran un ligero retraso en llegar a la etapa de crecimiento digital en comparación con los diploides. Recuerde utilizar la técnica estéril y eliminar y reemplazar completamente las capas completas de mesodermo y tejido de ectoderm del huésped embrionario con el fin de producir una extremidad injertada limpiamente.
Las extremidades mutantes se pueden amputar y puntuar para fenotipos de regeneración. Los alelos mutantes se pueden cuantificar con la secuenciación de próxima generación. En combinación con la mutagénesis CRISPR-Cas9, nuestra técnica de injerto nos ha permitido realizar una pantalla de selección negativa de genes específicos en extremidades heploide regeneradoras.
