Ce protocole permet la production de membres haploïdes mutagenisés qui peuvent être utilisés pour le dépistage génétique dans l’axolotl. Chez les haploïdes, même la mutagenèse de bas niveau peut produire une perte de phénotypes de fonction dans les cellules. Cette technique de greffage peut également être utilisée pour sauver les phénotypes mortels embryonnaires.
Cette méthode peut être utilisée pour étudier la régénération de toutes les espèces d’amphibiens qui peuvent être fécondées et greffées in vitro. Avant d’utiliser des embryons haploïdes comme donneurs, nous recommandons de pratiquer et de confirmer le succès des greffes entre les embryons diploïdes positifs et négatifs du GFP. Pour la préparation des donneurs de gibier féminins, anesthésier un axolotl femelle blanc ou blanc sexuellement mature pour servir de donneur de gamete.
Après avoir confirmé un manque de réponse à la simulation de douleur, utilisez une seringue d’insuline de calibre 30 pour injecter 0,15 millilitres de gonadotropine chorionique humaine dans le dorsale musculature du membre postérieur. Insérez la seringue à un angle de 45 degrés à la ligne médiane pour éviter tout contact avec la moelle épinière. Placez l’animal injecté dans la solution fraîche de Holtfreter à 40 % et transférez l’axolotl dans un réfrigérateur de 8 à 12 degrés Celsius pendant 48 heures.
Puis remettre la femelle à température ambiante. Pendant que la femelle pond des œufs, placez un mâle entièrement anesthésié en position supine sur des serviettes en papier humide sous un microscope disséquant et placez la pointe d’une pipette P1000 à la base du cloaque avec la main dominante. Placez l’autre index et le pouce de deux à trois centimètres rostral au bassin et pressez doucement l’animal tout en déplaçant les doigts vers les pattes postérieures pour rincer les échantillons d’urine spermique recueillant chaque échantillon dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
Ensuite, transférez cinq microlitres de chaque échantillon dans une boîte de Pétri pour inspecter la qualité du sperme à l’aide d’un microscope inversé. Après compter, diluer le sperme à une concentration de huit fois 10 à la quatrième cellule par millilitre dans 0,1X RRO stérile et transférer 0,5 microlitres de spermatozoïdes par ovule à une nouvelle boîte de Pétri. Ensuite, utilisez la pointe pipette pour étendre la suspension à une couche d’un millimètre d’épaisseur et utilisez un ascenseur en plastique pour placer l’échantillon de quatre centimètres des ampoules d’un croisement de 254 nanomètres pour l’irradiation à huit fois 10 à la cinquième microjoules par millimètre au carré.
Après avoir prélevé un échantillon de sperme sain, placez la femelle en position supine sur une pile de serviettes en papier humide et utilisez un mouvement de rinçage similaire pour extraire les œufs non fécondés de l’axolotl femelle. Ensuite, utilisez des forceps humides pour transférer les œufs dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Dans les 15 minutes qui ont pris la collecte, utilisez une pipette P10 pour distribuer le sperme irradié sur les ovules non fécondés enduisant chaque ovule de 0,25 à 0,5 microlitres de sperme inactivé.
Après avoir laissé les œufs reposer à température ambiante pendant 30 minutes, inonder les œufs de 0,1 X MMR. Trente minutes après l’hydratation, utiliser des forceps tranchants pour dejelly les oeufs et placer les oeufs à 18 degrés Celsius pour la microinjection dans les sept heures. Pour générer une chimère haploïde-diploïde, placez un donneur haploïde en bonne santé avec un ou deux embryons d’hôtes diploïdes positifs GFP assortis à l’intérieur de l’auge d’un plat d’opération pré-réfrigéré contenant un milieu chirurgical à un stade de refroidissement de 10 degrés Celsius ou inférieur.
Utilisez deux forceps droits autoclavés ultra fins pour enlever l’ensemble du bourgeon du membre et les couches de tissu ectoderm et mésodérme environnantes et mettre de côté le tissu hôte. Retirer une gaine tissulaire de taille équivalente du donneur d’haploïdes et placer la gaine de tissu haploïde sur la région correspondante de l’embryon hôte. Fixez le tissu à l’aide d’un éclat de verre rectangulaire autoclavé à partir d’un verre de couverture de microscope écrasé et pressez doucement le tissu dans le corps embryonnaire hôte.
Laissez l’ancre en place pendant 60 à 75 minutes en vérifiant toutes les 20 minutes pour confirmer que le verre n’a pas glissé avant d’utiliser les forceps pour décoller le fragment de verre de couverture. Transférer les embryons greffés dans un milieu chirurgical frais leur permettant de guérir à 8 à 12 degrés Celsius pendant la nuit avant de loger les embryons greffés individuellement dans des plaques de 12 ou 24 puits. 38,7 % des ovocytes se sont développés en embryons haploïdes normalement développés.
Au stade de la greffe, les embryons haploïdes présentent une courbure réduite le long de l’axe antérieur-postérieur et une enceinte incomplète de la prise de jaune. En outre, un microscope fluorescent peut être utilisé pour confirmer que les embryons haploïdes sont exempts d’expression GFP dérivée paternellement. Les greffes échouées et impures produisent une variété de phénotypes.
Lorsque les greffes sont propres et normalement développées, l’expression GFP doit être limitée principalement au plexus brachial, le réseau neuronal dérivé de la moelle épinière hôte. L’expression punctate GFP est également présente dans les cellules individuelles qui semblent être des neurones sensoriels dans les cellules hôtes dérivées du sang qui migrent dans le membre en développement. Lorsque des donneurs positifs à la DP sont utilisés, les membres haploïdes de greffe présentent une expression universelle de la DP.
Tout au long du développement, les membres haploïdes non mutagenisés sont significativement plus courts que les membres antérieurs diploïdes opposés chez les animaux chimériques. Les membres haploïdes non mutagenisés se régénèrent complètement, bien qu’ils démontrent un léger retard dans l’atteinte du stade de l’excroissance numérique par rapport aux diploïdes. N’oubliez pas d’utiliser une technique stérile et d’enlever et de remplacer complètement les couches complètes de tissu mésoderm et ectoderm de l’hôte embryonnaire afin de produire un membre proprement greffé.
Les membres mutants peuvent être amputés et marqués pour les phénotypes de régénération. Les allèles mutants peuvent être quantifiés avec le séquençage de prochaine génération. Combinée à la mutagenèse CRISPR-Cas9, notre technique de greffage nous a permis d’effectuer un dépistage négatif des gènes ciblés dans la régénération des membres haploïdes.
