פרוטוקול זה מאפשר ייצור של גפיים haploid mutagenized שניתן להשתמש בהם להקרנה גנטית ב axolotl. בהפלואידים, אפילו mutagenesis ברמה נמוכה יכול לייצר אובדן של פנוטיפים פונקציה בתוך תאים. טכניקת השתלה זו יכולה לשמש גם להצלת פנוטיפים קטלניים עובריים.
שיטה זו יכולה לשמש לחקר התחדשות בכל מין דו-חיים כי הוא נוח הפריה חוץ גופית השתלה. לפני השימוש בעוברים הפלואידים כתורמים, אנו ממליצים לתרגל ולאשר את הצלחת השתלים בין עוברים דיפלואידים חיוביים ושליליים של GFP. להכנת תורם גמטה נקבה, הרדמה בוגרת מינית לבן או לבן RFP נקבה axolotl לשמש תורם gamete.
לאחר אישור חוסר תגובה לסימולציה כאב, להשתמש מזרק אינסולין 30 מד להזריק 0.15 מיליליטר של גונדוטרופין כוריוני אנושי לתוך הגב השרירי לאיבר האחורי. הכנס את המזרק בזווית של 45 מעלות אל קו האמצע כדי למנוע מגע עם חוט השדרה. מניחים את החיה המוזרקת בתסרון טרי של 40% הולטפרטר ומעבירים את האקסולוטל למקרר של 8 עד 12 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
ואז להחזיר את הנקבה לטמפרטורת החדר. בזמן שהנקבה מטילה ביצים, מניחים זכר הרדמה מלא בתחתון העלוב על מגבות נייר לחות תחת מיקרוסקופ לנתח ולמקם את קצה פיפטה P1000 בבסיס הקלואקה עם היד הדומיננטית. מניחים את האצבע והאגודל האחרים 2-3 ס"מ על האגן וסוחטים בעדינות את החיה תוך כדי הזזת האצבעות לכיוון הרגליים האחוריות כדי לשטוף את דגימות השתן הזרעיות שאוספות כל דגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
לאחר מכן להעביר חמישה microliters מכל דגימה לתוך צלחת פטרי כדי לבדוק את איכות הזרע באמצעות מיקרוסקופ הפוך. לאחר הספירה, לדלל את הזרע לריכוז של שמונה פעמים 10 לתאים הרביעיים למיליליטר ב 0.1X סטרילי MMR ולהעביר 0.5 microliters של תאי זרע לכל ביצה לצלחת פטרי חדשה. לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה כדי להפיץ את ההשעיה לשכבה בעובי מילימטר אחד ולהשתמש במעלית פלסטיק כדי למקם את המדגם ארבעה סנטימטרים מן הנורות של crosslinker ננומטר 254 להקרנה בשמונה פעמים 10 כדי microjoules החמישי למילימטר בריבוע.
לאחר איסוף דגימת זרע בריאה, מניחים את הנקבה בתעריפה העל-חושית על ערימה של מגבות נייר לחות ולהשתמש בתנועה שטיפה דומה כדי לחלץ ביצים לא מופרות מן axolotl הנשי. לאחר מכן השתמש ממטרים רטובים כדי להעביר את הביצים לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ. בתוך 15 דקות של איסוף, להשתמש פיפטה P10 לחלק את הזרע מוקרן על הביצים מופרות ציפוי כל ביצה עם 0.25 כדי 0.5 microliters של זרע לא מוצמד.
לאחר שאפשר את הביצים לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, להציף את הביצים עם 0.1X MMR. שלושים דקות לאחר ההידרציה, השתמש במטלפים חדים כדי לדרדר את הביצים ולה מניח את הביצים ב 18 מעלות צלזיוס עבור microinjection בתוך שבע שעות. כדי ליצור כימרה פלואידית-דיפלואידית, מניחים תורם הפלואיד בריא אחד עם שלב אחד או שניים תואמים GFP חיובי דיפלואיד מארח עוברים בתוך השוקת של צלחת הפעלה מצוננת מראש המכיל מדיום כירורגי על 10 מעלות צלזיוס או בשלב קירור נמוך יותר.
השתמש בשני מלקחיים קצה ישר autoclaved דק במיוחד כדי להסיר את ניצן הגפיים כולו ואת שכבות רקמת ectoderm ו mesoderm שמסביב ולהניח בצד את הרקמה המארחת. מוציאים נדן רקמה בגודל שווה ערך מתורם ההפלואיד ומ מניחים את נדן רקמת התורם ההפואידית על האזור המתאים של העובר המארח. אבטחו את הרקמה עם שבר זכוכית מלבנית אוטוקלאבת מכיסוי מיקרוסקופ מרוסק ולחץ בעדינות על הרקמה לגוף העובר המארח.
השאירו את העוגן במקום במשך 60 עד 75 דקות בדיקה כל 20 דקות כדי לאשר כי הזכוכית לא החליקה לפני השימוש במקלפים כדי לקלף את שבר coverglass. מעבירים את העוברים הנצברים למדיום כירורגי טרי ומאפשרים להם להחלים בשמונה עד 12 מעלות צלזיוס בן לילה לפני שהם מאכלסים את העוברים התכולים בנפרד בצלחות 12 או 24 בארות. 38.7% מהוציטים התפתחו לעוברים הפלואידים שפותחו בדרך כלל.
בשלב השתל, עוברי הפלואיד מציגים עקמומיות מופחתת לאורך הציר האחורי-אחורי ומארז לא שלם של תקע החלמון. בנוסף, מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לשמש כדי לאשר את העוברים haploid הם ללא ביטוי GFP שמקורו אבהי. שתלים כושלים ולא טמאים מייצרים מגוון פנוטיפים.
כאשר השתלים נקיים ומפותחים בדרך כלל, ביטוי GFP צריך להיות מוגבל בעיקר מקלעת הזרוע, הרשת העצבית הנגזרת חוט השדרה המארח. ביטוי GFP Punctate קיים גם בתאים בודדים שנראים נוירונים חושיים בתאים מארחים שמקורם בדם הנודדים לתוך האיבר המתפתח. כאשר נעשה שימוש בתורמים חיוביים RFP, גפי שתל haploid להפגין ביטוי אוניברסלי של RFP.
לאורך כל ההתפתחות, גפי הפלואידים שאינם מוטגניים קצרים משמעותית מהלימות הנגדיות של הדיפלואידים בבעלי חיים כימריים. גפי הפלואידים שאינם מוטגים מתחדשים לחלוטין, אם כי הם מראים עיכוב קל בהגעה לשלב ההתרומת הדיגיטלי בהשוואה לדיפלואידים. זכור להשתמש בטכניקה סטרילית ולהסיר לחלוטין ולהחליף את שכבות רקמת mesoderm ו ectoderm מלא מן המארח העוברי על מנת לייצר איבר מושתל נקי.
איברים מוטנטים ניתן לקטוע הבקיע עבור פנוטיפים התחדשות. ניתן לכמת אללים מוטנטים באמצעות רצף הדור הבא. בשילוב עם מוטציה CRISPR-Cas9, טכניקת ההשתלה שלנו אפשרה לנו לנהל מסך בחירה שלילי של גנים ממוקדים בהתחדשות גפי ההפלואיד.
