يسهل هذا البروتوكول قياس موثوق به للخصائص الميكانيكية للغشاء من الدهنية البوليمر الاصطناعية وحقيقية باستخدام تقنية التطلع ميكروريبيت. هذه هي التقنية الوحيدة التي تسمح لمرونة الغشاء وعدم الاستقرار أن تمتد لتقييمها في تجارب واحدة. يتضمن هذا البروتوكول سلسلة من الإجراءات من إعداد الـ"إنس" إلى التقييم الميكانيكي.
من المهم جدا أن نكون صبورين وأن نحل أي قضايا تقنية عند ظهورها. التصور على هذه التقنيات أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية التعامل بشكل صحيح السطح الشعري وكيفية تنفيذ خطوة ما قبل الإجهاد الإلزامي. تظهر في الـ(فِيزل) بدون عيوب
وسوف يكون الإجراء التظاهر مارتن Fauquignon، وهو طالب دكتوراه من المختبر تعمل على تطوير الدهون البوليمر الهجين vesicles. قبل البدء في الإجراء مكان الزجاج البارد micropipette الشعيرات الدموية عموديا في أصحاب. وخفض أصحاب حتى يتم غمر النصائح في الطازجة المعدة الجلوكوز بوفين مصل الألبومين حل بين عشية وضحاها.
بحلول صباح اليوم التالي كان يجب أن يرتفع الحل حوالي سنتيمتر واحد في النصائح عن طريق عمل الشعيرات الدموية. باستخدام حقنة زجاجية 500 ميكرولترر، مجهزة الشعرية السيليكا تنصهر مرنة، ملء كل ماصة مع محلول الجلوكوز. ثم الطامح الحل من كل ماصة، قبل إعادة ملء الماصات مع محلول الجلوكوز الطازجة عدة مرات حتى كل من المصل كما تم إزالتها.
لإعداد غرفة التشكيل الكهربائي، أولاً تنظيف الشرائح ITO مع المذيبات العضوية المناسبة، وتحديد السطح موصل مع Ohmeter. قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية على الجانب موصل من كل شريحة مع شريط لاصق. تراجع واحد الشعيرات الدموية في حل ampivial حتى حوالي 5 microliters من الحل وقد تم جمعها من قبل عمل الشعرية.
ضع الشعيرات الدموية المحملة في اتصال مع مركز لوحة ITO زجاجية واحدة والانتشار بلطف الحل عبر الشريحة. عندما تبخر المذيب تماما، وتطبيق الحل مرتين أكثر كما أظهرت للتو. قبل إضافة طبقة من الشحوم خالية من السيليكون على جانبي فتح س حلقة الفضاء حول منطقة الترسيب.
المقبل، وضع الوجه موصل من لوحة زجاجية الثاني ITO على الجزء العلوي من الفضاء، ووضع غرفة الكهربائية تحت فراغ لمدة 3 ساعات لإزالة أي آثار من المذيبات العضوية. بالنسبة للتشهّد الكهربائي للـ "فيسيكلات يونيميللار العملاقة"، قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية بالمولد. تعيين تردد مولد إلى 10 هيرتز، والسعة إلى 2 فولت، الذروة إلى الذروة.
عندما تم تعيين الجهد، واستخدام حقنة مجهزة بإبرة قطر داخلي 0.8 ملليمتر لحقن ملليلتر واحد من محلول السكروز الضرس 0.1 في الغرفة، وترك الغرفة تحت الجهد المطبق والتردد لمدة 75 دقيقة. في نهاية التشكيل الكهربائي، قم بإيقاف تشغيل المولد. واستخدام حقنة ملليلتر واحد لpirate حجم صغير من الحل حتى يتم إنتاج فقاعة الهواء داخل الغرفة.
إمالة الغرفة قليلا لنقل الفقاعة إلى الغرفة، ومساعدة الفُيْيْسَر على الانفصال عن سطح الشريحة. و استلهم حجم المحلّل بالكامل في المحاقن ثم، نقل حل الفينة إلى أنبوب بلاستيكي ملليلتر واحد.
لإعداد المواد لmicromanipulation، الطامح لخلق تدفق المياه، وخزان من المياه النقية، إلى حامل واحد. والاستفادة بخفة في حين رفع خزان للقضاء على أي فقاعات الهواء، وخلق ضغط إيجابي. املأ الشعيرات الدموية المغلفة بالمصل بمحلول الجلوكوز الطازج حتى تتشكل قطرة عند الطرف.
إزالة أنابيب حقنة من حامل معدني لخلق تدفق المياه طفيفة في نهاية الحامل، وتحويل شعري رأسا على عقب لتوصيل انخفاض الجلوكوز إلى تدفق المياه. ثم، المسمار الشعرية وحامل معا. لوضع ماصة، الغراء اثنين من الشرائح الزجاجية من مرحلة الألومنيوم حسب الطلب جنبا إلى جنب مع الشحوم فراغ.
وتثبيت الشرائح على مرحلة المجهر. باستخدام ماصة ملليلتر واحد، تشكل الغضروف المفصلي بين الشرائح اثنين مع 0.1 جلوكوز الضرس. ضع الماصة وحاملها على وحدة المحرك في المايكرومانبولاتور.
تشديد مقبض الباب، واستخدام عصا التحكم في وضع خشنة. خفض micropipette بالقرب من الغضروف المفصلي الجلوكوز. استخدم وضع الغرامة لضبط موضع الطرف إلى مركز الغضروف المفصلي.
غمر التلميح في الجلوكوز لتنظيف أسطحه الخارجية والداخلية. بعد بضع دقائق، سحب الشعيرات الدموية من الغضروف المفصلي واستبدال الجلوكوز مع الغضروف المفصلي الطازج. التعرق اثنين من microliters من Vesicles Unilamellar العملاقة في 0.1 السكروز الضرس, في 20 ملليلتر تلميح micropipette.
أدخل الـ(فِيَسِكِس) في الغضروف المفصلي استخدام المجهر لمراقبة الحويصلات في الجزء السفلي من غرفة الشريحة. عندما يتم انكماش الفُرَض قليلاً، يُعاد إدخال ماصة الشفط، والتركيز على طرف الماصات.
ثم تعيين ارتفاع خط الأساس من خزان المياه إلى الضغط الذي يتم إيقاف حركة الجسيمات. تحيط الغضروف المفصلي مع الزيوت المعدنية لمنع التبخر. لتنفيذ تجربة طموح ميكروبيبيت، قم بخفض طرف الماصات في الغضروف المفصلي.
إنشاء كمية صغيرة من ضغط الشفط لpirspirate في إنحدار. وينبغي أن غشاء من vesicle مختارة تتذبذب قليلا وينبغي أن لا تقدم أي عيوب مرئية. استخدام micromanipulator لرفع الماصات إلى مستوى أعلى لعزل vesicle يستنشق من الاحياء الأخرى.
خفض خزان المياه إلى ما يقرب من 10 سنتيمترات لprestress في vesicle قبل رفع الخزان للعودة الضغط إلى القيمة الأولية. من ارتفاع 0.5 سم ، تقلل ببطء ضغط الشفط حتى يتم الوصول إلى الضغط الذي يتقلب الغشاء. ثم زيادة الضغط لتصور واضح لسان في الطرف، وطول الإسقاط من ميكرون قليلة.
لتحديد معامل الانحناء، وزيادة ضغط الشفط، ميكرومتر واحد في وقت واحد بطريقة تدريجية. حتى يتم الوصول إلى 0.5 إلى 0.8 milliNewtons لكل متر. الانتظار خمس ثوان، وأخذ لقطة من اللسان بعد كل خطوة.
لتحديد المنطقة معامل الضغط، والتوتر والإجهاد المستمر لزيادة ضغط الشفط من 0.5 milliNewtons لكل متر حتى يتم التوصل إلى التوتر تمزق. في هذه التجربة التمثيلية كانت معامل الضغط في المنطقة وسلالة التحلل لـ POPC متفقة تمامًا مع ما هو متوقع من المؤلفات. في هذا الجدول يمكن ملاحظة القيم النموذجية للبوليمرات التي تم الحصول عليها.
لاحظ أن صلابة الغشاء التي تم الحصول عليها من ثنائي لوك copolymers هو أكبر بكثير من تلك التي تم الحصول عليها من copolymer تريبلوك. ومن المثير للاهتمام, باستخدام كوبوليمر diblock, فمن الممكن الحصول على العملاق الهجين Unilamilar الدهون البوليمر Vesicles التي تثبت صلابة أكثر قوة من تلك التي تقاس للليبوسومات. يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدًا لقياس الفُنية مع ماصة، على سبيل المثال، لقياس نفاذية الغشاء من خلال الصدمة الجسدية.
تأكد من إكمال كل خطوة بدقة ودقة، خاصة عند إعداد اتصال تريبيون. وقد تم استغلال هذه التقنية لفهم الأصل المادي للغشاء الانشطار، من خلال قياس التوتر الخطي على الحدود الرئيسية في حويصلات معدلة.
