이 프로토콜은 마이크로 피펫 포부 기술을 사용하여 합성 및 실제 폴리머 지질 소포의 멤브레인 기계적 특성을 신뢰할 수 있는 측정을 용이하게 합니다. 이것은 멤브레인 유연성과 불안정을 단일 실험에서 평가 할 수있는 유일한 기술입니다. 이 프로토콜에는 소포 준비부터 기계적 평가에 이르는 일련의 절차가 포함됩니다.
인내심을 갖고 기술적 문제를 해결하는 것이 매우 중요합니다. 이러한 기술의 시각화는 모세관 표면을 올바르게 치료하는 방법과 필수 예비 단계를 수행하는 방법을 이해하는 데 중요합니다. 결함없이 소포를 표시합니다.
시연 절차는 하이브리드 폴리머 지질 소포의 개발에 종사하는 실험실에서 박사 과정 학생 인 Martin Fauquignon이 될 것입니다. 절차를 시작하기 전에 차가운 유리 마이크로 피펫 모세 혈관을 홀더에 수직으로 배치합니다. 그리고 팁이 하룻밤 갓 준비 된 포도당 소 세럼 알부민 용액에 몰입 될 때까지 홀더를 낮춥다.
다음날 아침까지 모세관 작용에 의해 약 1센티미터 정도 상승하여 팁으로 들어와야 합니다. 유연한 융합 실리카 모세관이 장착된 500 마이크로리터 유리 주사기를 사용하여 각 파이펫을 포도당 용액으로 채웁니다. 그런 다음 각 파이펫에서 용액을 흡인한 다음, 모든 혈청이 제거될 때까지 신선한 포도당 용액으로 파이펫을 여러 번 보충합니다.
전기 형성 챔버를 준비하기 위해 먼저 ITO를 적절한 유기 용매로 밀어 내고 오미터로 전도성 표면을 식별합니다. 접착제 테이프로 각 슬라이드의 전도성 측면에 전선을 부착합니다. 용액의 약 5 마이크로 리터가 모세관 작용에 의해 수집 될 때까지 용액에 하나의 모세관을 찍어.
로드된 모세관을 하나의 유리 ITO 플레이트의 중앙과 접촉하고 용액을 슬라이드 전체에 부드럽게 분산시십시오. 용매가 완전히 증발하면 방금 설명한 대로 용액을 두 번 더 적용하십시오. 증착 영역 주변에 열린 O-링 스페이서의 양쪽에 실리콘 프리 그리스 층을 추가하기 전에.
다음으로, 제2 ITO 유리 판의 전도성 면을 스페이서 위에 놓고, 유기 용매의 흔적을 제거하기 위해 3시간 동안 감전 챔버를 진공 아래에 놓는다. 거대한 Unilamellar Vesicles의 전기 형성을 위해 전기 와이어를 발전기에 연결합니다. 발전기 주파수를 10 헤르츠로 설정하고 진폭을 2 볼트로 설정하여 피크에서 피크로 설정합니다.
전압이 설정된 경우 0.8mm 내경 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 0.1 개의 어금니 자당 용액1 밀리리터를 챔버에 주입하고 75 분 동안 적용 된 전압 및 주파수 아래에 챔버를 둡니다. 전기 형성의 끝에서 발전기를 끕니다. 그리고 공기 거품이 챔버 내부에 생성 될 때까지 용액의 작은 볼륨을 흡인하는 하나의 밀리리터 주사기를 사용합니다.
챔버를 약간 기울여 거품을 챔버로 이동하고 소포가 슬라이드 표면에서 분리하는 데 도움이됩니다. 그리고 주사기에 용액의 전체 볼륨을 흡인. 그런 다음 소포 용액을 1 밀리리터 플라스틱 튜브로 옮킨다.
마이크로 조작을 위한 재료를 설정하려면, 흡인을 생성하여 순수한 물 탱크인 한 홀더에게 물을 만듭니다. 그리고 탱크를 들어 올리면서 가볍게 탭하여 기포를 제거하고 양압을 만듭니다. 끝에 드롭 형태가 될 때까지 신선한 포도당 용액으로 혈청 코팅 모세관을 채웁니다.
금속 홀더에서 주사기 튜브를 제거하여 홀더 끝에 약간의 물 흐름을 만들고 모세관을 거꾸로 뒤집어 포도당 강하를 물 흐름에 연결합니다. 그런 다음 모세관과 홀더를 함께 나사로 묶습니다. 파이펫을 배치하려면 맞춤형 알루미늄 스테이지에서 진공 그리스와 함께 두 개의 유리 슬라이드를 붙입니다.
그리고 현미경 단계에 슬라이드를 설치합니다. 1 밀리 리터 파이펫을 사용 하 여 0.1 어금니 포도 당 두 슬라이드 사이 반 월 상 연 골을 형성. 피펫과 홀더를 마이크로 조작기의 모터 장치에 놓습니다.
클램핑 노브를 조이고 컨트롤 패널 조이스틱을 거친 모드로 사용합니다. 포도당 반월 상 연골 근처 마이크로 피펫을 낮춥다. 미세 모드를 사용하여 팁의 위치를 반월 상 연골의 중심으로 조정합니다.
포도당에 팁을 담그고 외부 표면과 내부 표면을 청소하십시오. 몇 분 후, 반월 상 연골에서 모세관을 철회하고 신선한 반월 상 연골으로 포도당을 대체. 0.1 어금니 자당에 자이언트 유니라멜라 채소의 마이크로리터 2개를 20밀리리터 마이크로피펫 팁으로 흡입합니다.
반월 상 연골에 소포를 소개합니다. 현미경을 사용하여 슬라이드 챔버 의 바닥에있는 소포를 관찰하십시오. 소포가 약간 수축되면 흡입 파이펫을 다시 삽입하고 파이펫 끝에 집중하십시오.
그런 다음 물 탱크의 기준높이를 입자의 움직임이 중지되는 압력으로 설정합니다. 반월 상 연골을 미네랄 오일로 둘러싸서 증발을 방지합니다. 마이크로파이펫 흡부 실험을 수행하려면 파이펫 팁을 반월 상 연골으로 낮춥춥시다.
소량의 흡입 압력을 만들어 소포를 흡인시합니다. 선택한 소포의 멤브레인은 약간 변동해야하며 눈에 보이는 결함을 제시해서는 안됩니다. 마이크로 조작기를 사용하여 파이펫을 더 높은 수준으로 올려 다른 소포로부터 흡인 된 소포를 격리하십시오.
물 탱크를 약 10센티미터로 낮추어 탱크를 들어 올리기 전에 소포를 미리 주조하여 압력을 초기 값으로 되돌립니다. 0.5센티미터의 높이에서 멤브레인이 변동하는 압력이 도달할 때까지 흡입 압력을 천천히 줄입니다. 그런 다음 몇 미크론의 투영 길이인 끝에 혀를 명확하게 시각화하는 압력을 증가시다.
굽힘 계수를 결정하려면, 흡입 압력을 증가, 단계적 방식으로 한 번에 하나의 마이크로 미터. 미터당 0.5 ~0.8 밀리까지뉴턴에 도달합니다. 5초 를 기다린 후 각 단계 후에 혀의 스냅샷을 찍습니다.
영역 압축성 변성을 결정하기 위해, 용해장력과 균주는 파열 장력에 도달할 때까지 미터당 0.5밀리에서 흡입 압력을 계속 증가시키고 있다. 이 대표적인 실험에서 POPC에 대한 영역 압축성 변조기 및 용해 변형은 문헌에서 기대하는 것과 완벽하게 일치하였다. 이 표에서 얻어진 중합체에 대한 전형적인 값을 관찰할 수 있다.
디블록 중합체로부터 얻은 멤브레인의 인성은 삼중공합체로부터 얻은 멤브레인보다 훨씬 큽하다. 흥미롭게도, 디블록 중합체를 사용하여, 리포솜에 대해 측정된 것보다 더 강력한 인성을 보여주는 거대한 하이브리드 유니라미라 지질 폴리머 소포를 얻을 수 있다. 이 프로토콜은 예를 들어, 아스매틱 쇼크를 통해 멤브레인의 투과성을 측정하는 파이펫으로 소포를 측정하는 데 도움이 될 수 있다.
특히 트리뷴 연결을 설정할 때 엄격하고 정밀하게 각 단계를 완료해야합니다. 이 기술은 수정 된 소포의 주요 경계에서 라인 장력의 측정을 통해 멤브레인 분열의 물리적 기원을 이해하기 위해 악용되었습니다.
