Этот протокол облегчает надежное измерение мембранных механических свойств синтетического и реального полимерного липидового везикула с использованием метода аспирации микропипеда. Это единственный метод, который позволяет мембранной гибкости и нестабильности, которые будут растянуты для оценки в одиночных экспериментах. Этот протокол включает в себя ряд процедур от подготовки везикулы до механической оценки.
Очень важно быть терпеливым и решать любые технические вопросы по мере их возникновения. Визуализация этих методов имеет решающее значение для понимания того, как правильно лечить капиллярной поверхности и как выполнить обязательный шаг престресс. Отображение везикулы без дефектов.
Демонстрацией процедуры станет Мартин Фаукиньон, аспирант лаборатории, работающий над разработкой гибридных полимерных липидов. Перед началом процедуры поместите холодные стеклянные капилляры из стекла вертикально в держатели. И опустите держатели до тех пор, пока кончики не будут погружены в свежеприготовленный раствор сыворотки крупного рогатого скота на ночь.
К следующему утру раствор должен был поднялся примерно на один сантиметр в кончики капиллярного действия. Используя стеклянный шприц из 500 микролитров, оснащенный гибким сплавленным кремниевым капилляром, заполните каждую пипетку раствором глюкозы. Затем аспирировать раствор из каждой пипетки, прежде чем пополнить пипетки свежим раствором глюкозы несколько раз, пока вся сыворотка не будет удалена.
Чтобы подготовить электроформацию камеры, сначала чистый ITO слайды с соответствующим органическим растворителем, и определить проводящие поверхности с Ohmeter. Прикрепите электрические провода на проводящий бок каждого слайда клейкой лентой. Опустите одну капиллярную в ампивиальный раствор до тех пор, пока около 5 микролитров раствора не будут собраны капиллярным действием.
Поместите загруженный капилляр в контакт с центром одной стеклянной пластины ITO и аккуратно распределите раствор по слайду. Когда растворитель полностью испарится, нанесите раствор еще два раза, как только что продемонстрировано. перед добавлением слоя без силикона смазки по обе стороны от открытого O-кольца спейсера вокруг области осаждения.
Затем поместите проводящий лицом второй стеклянной пластины ITO на верхней части спейсера, и поместите электроформацию камеры под вакуум в течение 3 часов, чтобы удалить любые следы органического растворителя. Для электроформации гигантских Unilamellar Vesicles подключите электрические провода к генератору. Установите частоту генератора до 10 Герц, и амплитуда до 2 Вольт, пик до пика.
Когда напряжение было установлено, используйте шприц, оснащенный иглой внутреннего диаметра 0,8 миллилитра 0,1 молярного раствора сахарозы в камеру, и оставьте камеру под прикладным напряжением и частотой в течение 75 минут. В конце электроформации выключите генератор. И используйте один миллилитр шприц, чтобы аспирировать небольшой объем раствора, пока пузырь воздуха производится внутри камеры.
Слегка наклоните камеру, чтобы переместить пузырь в камеру, и помочь пузырькам отделиться от поверхности слайда. И аспирировать весь объем раствора в шприц. Затем перенесите раствор пузырьков в одну миллилитровую пластиковую трубку.
Для настройки материалов для микроманипуляции, аспирата для создания потока воды, резервуар чистой воды, к одному держателю. И слегка нажмите при подъеме бака, чтобы устранить любые пузырьки воздуха, и создать положительное давление. Заполните капилляр с покрытием сыворотки свежим раствором глюкозы до тех пор, пока капля не образуется на кончике.
Снимите трубку шприца с металлического держателя, чтобы создать небольшой поток воды в конце держателя, и поверните капилляр вверх дном, чтобы соединить каплю глюкозы с потоком воды. Затем, винт капилляров и держатель вместе. Чтобы распоять пипетки, клей два стеклянных слайда из изготовленной на заказ алюминиевой сцены вместе с вакуумной смазкой.
И установите слайды на сцену микроскопа. Используя одноми миллилитровую пипетку, сформирует мениск между двумя слайдами с 0,1 молярной глюкозой. Поместите пипетки и ее держатель на моторный блок микроманипулятора.
Затяните ручку зажима и используйте джойстик панели управления в грубом режиме. Опустите микропипет возле мениска глюкозы. Используйте прекрасный режим, чтобы настроить положение кончика к центру мениска.
Погрузите наконечник в глюкозу, чтобы очистить ее внешние и внутренние поверхности. Через несколько минут свясть капилляр из мениска и заменить глюкозу свежим мениска. Аспирировать два микролитров гигантских Unilamellar Vesicles в 0,1 молярной сахарозы, в 20 миллилитров микропипета отзыв.
Ввези пузырьки в мениска. Используйте микроскоп для наблюдения за пузырьками в нижней части слайд-камеры. Когда пузырьки слегка спущены, повторно засасывания пипетки, и сосредоточиться на кончике пипетки.
Затем установите базовую высоту резервуара для воды на давление, при котором движение частиц останавливается. Окружите мениска минеральным маслом, чтобы предотвратить испарение. Для проведения эксперимента по аспирации микропайпетов опустите кончик пипетки в мениск.
Создайте небольшое количество всасывающего давления, чтобы аспирировать пузырьк. Мембрана выбранного везикулы должна слегка колебаться и не должна иметь видимых дефектов. Используйте микроманипулятор, чтобы поднять пипетку на более высокий уровень, чтобы изолировать аспирированное везикулу от других пузырьков.
Опустите резервуар для воды примерно до 10 сантиметров, чтобы подстегить везикулу, прежде чем поднять бак, чтобы вернуть давление к первоначальному значению. С высоты 0,5 сантиметра медленно уменьшай всасывающее давление до тех пор, пока не будет достигнуто давление, при котором мембрана будет колебаться. Затем увеличить давление, чтобы четко визуализировать язык в кончике, длина проекции несколько микрон.
Чтобы определить изгиб модула, увеличить давление всасывания, один микрометр в то время, в шаг за шагом образом. До тех пор, пока не будет достигнуто от 0,5 до 0,8 миллиньютонов на метр. Ожидание пять секунд, и принимая снимок языка после каждого шага.
Для определения области сжатия модуль, а также напряжение и напряжение лиза продолжают увеличивать всасывающее давление с 0,5 миллиньютонов на метр до тех пор, пока не будет достигнуто напряжение разрыва. В этом репрезентативном эксперименте модуль сжатия области и штамм лиза для POPC были в полном согласии с тем, что ожидалось от литературы. В этой таблице можно наблюдать типичные значения для полученных полимером.
Обратите внимание, что прочность мембраны, полученной из диблок-кополимеров, намного больше, чем у тех, которые получены из триблок-кополимера. Интересно, что с помощью диблок-кополимера можно получить гигантский гибридный unilamilar Lipid Polymer Vesicles, который демонстрирует более надежную прочность, чем измеряется для липосом. Этот протокол может быть полезен для измерения пузырьков с помощью пипетки, например, для измерения проницаемости мембраны с помощью асматического шока.
Будьте уверены, чтобы завершить каждый шаг с строгостью и точностью, особенно при настройке трибуны связи. Этот метод был использован для понимания физического происхождения деления мембраны, путем измерения напряжения линии на основных границах в модифицированных пузырьках.
