Questo protocollo facilita una misurazione affidabile delle proprietà meccaniche della membrana della vescicola lipidica polimerica sintetica e reale utilizzando una tecnica di aspirazione di micropipette. Questa è l'unica tecnica che consente di allungare la flessibilità e l'instabilità della membrana in singoli esperimenti. Questo protocollo prevede una serie di procedure, dalla preparazione della vescicola alla valutazione meccanica.
È molto importante essere pazienti e risolvere eventuali problemi tecnici man mano che si presentano. La visualizzazione su queste tecniche è fondamentale per capire come trattare correttamente la superficie capillare e come eseguire la fase di precompresso obbligatoria. Mostrando la vescicola senza difetti.
A dimostrare la procedura sarà Martin Fauquignon, dottorando del laboratorio che lavora allo sviluppo di vescicole lipidiche polimeriche ibride. Prima di iniziare la procedura posizionare i capillari di micropipette di vetro freddo verticalmente nei supporti. E abbassare i supporti fino a quando le punte sono immerse nella soluzione di albumina di siero bovino di glucosio appena preparata durante la notte.
Entro la mattina successiva la soluzione dovrebbe essere salita di circa un centimetro nelle punte per azione capillare. Utilizzando una siringa in vetro da 500 microliter, dotata di un capillare flessibile di silice fusa, riempire ogni pipetta con la soluzione di glucosio. Quindi aspirare la soluzione da ogni pipetta, prima di riempire le pipette con soluzione di glucosio fresco più volte fino a quando tutto il siero non è stato rimosso.
Per preparare una camera di elettroformazione, pulire prima le diapositive ITO con un solvente organico appropriato e identificare la superficie conduttiva con un Ohmeter. Attaccare fili elettrici sul lato conduttivo di ogni diapositiva con nastro adesivo. Immergere un capillare in soluzione ampiviale fino a quando circa 5 microlitri della soluzione sono stati raccolti per azione capillare.
Posizionare il capillare caricato a contatto con il centro di una piastra ITO in vetro e stendere delicatamente la soluzione attraverso lo scivolo. Quando il solvente è completamente evaporato, applicare la soluzione altre due volte come appena dimostrato. prima di aggiungere uno strato di grasso privo di silicio su entrambi i lati del distanziale O-ring aperto intorno all'area di deposizione.
Quindi, posizionare la faccia conduttiva di una seconda lastra di vetro ITO sulla parte superiore del distanziale e posizionare la camera di elettroformazione sotto vuoto per 3 ore per rimuovere eventuali tracce di solvente organico. Per l'elettroformazione delle vescicole unilamellari giganti, collegare i fili elettrici al generatore. Impostare la frequenza del generatore su 10 Hertz, e l'ampiezza su 2 Volt, picco al picco.
Una volta impostata la tensione, utilizzare una siringa dotata di un ago di diametro interno di 0,8 millimetri per iniettare un millilitro di soluzione di saccarosio molare 0,1 nella camera e lasciare la camera sotto la tensione e la frequenza applicate per 75 minuti. Al termine dell'elettroformazione, spegnere il generatore. E utilizzare la siringa da un millilitro per aspirare un piccolo volume di soluzione fino a quando non viene prodotta una bolla d'aria all'interno della camera.
Inclinare leggermente la camera per spostare la bolla nella camera e per aiutare le vescicole a staccarsi dalla superficie di scorrimento. E aspirare l'intero volume di soluzione nella siringa. Quindi, trasferire la soluzione di vescicola in un tubo di plastica da un millilitro.
Per impostare i materiali per la micromanipolazione, aspirare a creare un flusso d'acqua, un serbatoio di acqua pura, a un supporto. E toccare leggermente mentre si solleva il serbatoio per eliminare eventuali bolle d'aria e creare pressione positiva. Riempire un capillare rivestito di siero con soluzione di glucosio fresco fino a quando non si forma una goccia sulla punta.
Rimuovere i tubi della siringa dal supporto metallico per creare un leggero flusso d'acqua all'estremità del supporto e capovolgere il capillare per collegare la goccia di glucosio al flusso d'acqua. Quindi, avvitare il capillare e il supporto insieme. Per posizionare la pipetta, incollare due vetrini da uno stadio di alluminio su misura insieme al grasso sottovuoto.
E installare le diapositive su una fase di microscopio. Usando una pipetta millilitro, formare un menisco tra le due diapositive con 0,1 glucosio molare. Posizionare la pipetta e il suo supporto sull'unità motore del micromanipolatore.
Stringere la manopola di bloccaggio e utilizzare il joystick del pannello di controllo in modalità grossolana. Abbassare la micropipetta vicino al menisco di glucosio. Utilizzare la modalità fine per regolare la posizione della punta al centro del menisco.
Immergere la punta nel glucosio per pulirne le superfici esterne ed interne. Dopo alcuni minuti, ritirare il capillare dal menisco e sostituire il glucosio con un menisco fresco. Aspirare due microlitri di vescicole unilamellari giganti in saccarosio molare 0,1, in una punta di micropipetta da 20 millilitri.
Introdurre le vescicole nel menisco. Utilizzare il microscopio per osservare le vescicole nella parte inferiore della camera scorrevole. Quando le vescicole sono leggermente sgonfie, reinserire la pipetta di aspirazione e concentrarsi sulla punta della pipetta.
Quindi impostare l'altezza di base del serbatoio dell'acqua sulla pressione alla quale viene fermato il movimento delle particelle. Circondare il menisco con olio minerale per evitare l'evaporazione. Per eseguire un esperimento di aspirazione della micropipetta, abbassare la punta della pipetta nel menisco.
Creare una piccola quantità di pressione di aspirazione per aspirare una vescicola. La membrana della vescicola selezionata dovrebbe fluttuare leggermente e non presentare difetti visibili. Utilizzare il micromanipolatore per alzare la pipetta a un livello superiore per isolare la vescicola aspirata da altre vescicole.
Abbassare il serbatoio dell'acqua a circa 10 centimetri per precompressire la vescicola prima di sollevare il serbatoio per riportare la pressione al valore iniziale. Da un'altezza di 0,5 centimetri, diminuire lentamente la pressione di aspirazione fino a raggiungere una pressione alla quale la membrana fluttua. Quindi aumentare la pressione per visualizzare chiaramente una lingua nella punta, la lunghezza di proiezione di alcuni micron.
Per determinare il modulo di piegatura, aumentare la pressione di aspirazione, un micrometro alla volta in modo graduale. Fino a quando non viene raggiunto da 0,5 a 0,8 milliNewton per metro. Attendere cinque secondi e scattare un'istantanea della lingua dopo ogni passaggio.
Per determinare il modulo di comprimibilità dell'area e la tensione e la tensione dellalisi continuano ad aumentare la pressione di aspirazione da 0,5 milliNewton per metro fino a raggiungere la tensione di rottura. In questo esperimento rappresentativo il modulo di comprimibilità dell'area e il ceppo di lysis per POPC erano in perfetto accordo con quello previsto dalla letteratura. In questa tabella si possono osservare valori tipici per i polimeri ottenuti.
Si noti che la tenacità della membrana ottenuta dai copolimeri di blocco è di gran lunga maggiore di quelle ottenute dal copolimero triblocco. È interessante notare che, utilizzando il copolimero di blocco, è possibile ottenere vescicole polimeriche lipidiche unilamilari ibride giganti che dimostrano una tenacità più robusta di quella misurata per i liposomi. Questo protocollo può essere utile per misurare la vescicola con una pipetta, ad esempio, per misurare la permeabilità della membrana attraverso uno shock asmatico.
Assicurati di completare ogni passaggio con rigore e precisione, specialmente quando si imposta la connessione della tribuna. Questa tecnica è stata sfruttata per comprendere l'origine fisica della fissione a membrana, attraverso la misurazione della tensione della linea ai confini principali nelle vescicole modificate.
