Este protocolo facilita una medición fiable de las propiedades mecánicas de membrana de la vesícula de lípido de polímero sintético y real utilizando una técnica de aspiración de micropipeta. Esta es la única técnica que permite que la flexibilidad de la membrana y la inestabilidad se estiren para ser evaluadas en experimentos individuales. Este protocolo implica una serie de procedimientos desde la preparación de la vesícula hasta la evaluación mecánica.
Es muy importante ser paciente y resolver cualquier problema técnico a medida que surgen. La visualización de estas técnicas es fundamental para comprender cómo tratar adecuadamente la superficie capilar y cómo realizar el paso de pretensado obligatorio. Mostrando la vesícula sin defectos.
El procedimiento de demostración será Martin Fauquignon, un estudiante de doctorado del laboratorio que trabaja en el desarrollo de vesículas de lípidos de polímero híbrido. Antes de comenzar el procedimiento coloque los capilares de micropipeta de vidrio frío verticalmente en los soportes. Y baje los soportes hasta que las puntas se sumerjan en una solución de albúmina sérica bovina de glucosa recién preparada durante la noche.
A la mañana siguiente la solución debería haber subido alrededor de un centímetro en las puntas por acción capilar. Usando una jeringa de vidrio de 500 microlitros, equipada con un capilar flexible de sílice fusionada, llene cada pipeta con la solución de glucosa. A continuación, aspirar la solución de cada pipeta, antes de rellenar las pipetas con solución de glucosa fresca varias veces hasta que se haya eliminado todo el suero.
Para preparar una cámara de electroformación, primero limpie los portaobjetos ITO con un disolvente orgánico adecuado e identifique la superficie conductora con un ohmeter. Coloque los cables eléctricos en el lado conductor de cada diapositiva con cinta adhesiva. Sumerja un capilar en solución ampivial hasta que se hayan recogido aproximadamente 5 microlitros de la solución por acción capilar.
Coloque el capilar cargado en contacto con el centro de una placa ITO de vidrio y extienda suavemente la solución a través de la corredera. Cuando el disolvente se haya evaporado por completo, aplique la solución dos veces más como se acaba de demostrar. antes de añadir una capa de grasa libre de silicio en ambos lados del espaciador de junta tórica abierto alrededor del área de deposición.
A continuación, coloque la cara conductora de una segunda placa de vidrio ITO en la parte superior del espaciador y coloque la cámara de electroformación bajo vacío durante 3 horas para eliminar cualquier rastro de disolvente orgánico. Para la electroformación de las Vesículas Unilamellar Gigantes, enchufe los cables eléctricos en el generador. Establezca la frecuencia del generador en 10 Hertz, y la amplitud a 2 Voltios, pico a pico.
Cuando se haya ajustado la tensión, utilice una jeringa equipada con una aguja de 0,8 milímetros de diámetro interior para inyectar un mililitro de solución de sacarosa molar 0,1 en la cámara, y deje la cámara bajo la tensión y frecuencia aplicadas durante 75 minutos. Al final de la electroformación, apague el generador. Y utilice la jeringa de un mililitro para aspirar un pequeño volumen de solución hasta que se produzca una burbuja de aire dentro de la cámara.
Incline ligeramente la cámara para mover la burbuja a la cámara y para ayudar a que las vesículas se desprendan de la superficie del deslizamiento. Y aspirar todo el volumen de solución en la jeringa. A continuación, transfiera la solución de vesícula a un tubo de plástico de un mililitro.
Para configurar los materiales para la micromanipulación, aspirar a crear un flujo de agua, un tanque de agua pura, a un soporte. Y toque ligeramente mientras eleva el tanque para eliminar cualquier burbuja de aire, y para crear presión positiva. Llene un capilar recubierto de suero con solución fresca de glucosa hasta que se forme una gota en la punta.
Retire el tubo de la jeringa del soporte metálico para crear un ligero flujo de agua al final del soporte, y gire el capilar boca abajo para conectar la gota de glucosa al flujo de agua. A continuación, atornille el capilar y el soporte. Para colocar la pipeta, pegue dos portaobjetos de vidrio de una etapa de aluminio hecha a medida junto con grasa al vacío.
E instale las diapositivas en una etapa del microscopio. Usando una pipeta de un mililitro, forme un menisco entre los dos portaobjetos con 0,1 de glucosa molar. Coloque la pipeta y su soporte en la unidad de motor del micromaniprógrafo.
Apriete la perilla de sujeción y utilice el joystick del panel de control en modo grueso. Baje la micropipeta cerca del menisco de glucosa. Utilice el modo fino para ajustar la posición de la punta al centro del menisco.
Sumerja la punta en la glucosa para limpiar sus superficies externas e internas. Después de unos minutos, retira el capilar del menisco y reemplaza la glucosa con un menisco fresco. Aspirar dos microlitros de vesículas unilamelares gigantes en 0,1 sacarosa molar, en una punta de micropipeta de 20 mililitros.
Introducir las vesículas en el menisco. Utilice el microscopio para observar las vesículas en la parte inferior de la cámara deslizante. Cuando las vesículas estén ligeramente desinfladas, vuelva a insertar la pipeta de succión y concéntrese en la punta de la pipeta.
A continuación, establezca la altura de línea base del tanque de agua a la presión a la que se detiene el movimiento de las partículas. Rodear el menisco con aceite mineral para evitar la evaporación. Para realizar un experimento de aspiración de micropipeta, baje la punta de la pipeta en el menisco.
Cree una pequeña cantidad de presión de succión para aspirar una vesícula. La membrana de la vesícula seleccionada debe fluctuar ligeramente y no debe presentar defectos visibles. Utilice el micromaniprógrafo para elevar la pipeta a un nivel superior para aislar la vesícula aspirada de otras vesículas.
Baje el tanque de agua a aproximadamente 10 centímetros para pretensar la vesícula antes de elevar el tanque para devolver la presión al valor inicial. A partir de una altura de 0,5 centímetros, disminuya lentamente la presión de succión hasta alcanzar una presión a la que fluctúa la membrana. A continuación, aumentar la presión para visualizar claramente una lengua en la punta, la longitud de proyección de unos pocos micras.
Para determinar el módulo de flexión, aumente la presión de aspiración, un micrómetro a la vez de manera escalonada. Hasta que se alcancen de 0,5 a 0,8 milinewtons por metro. Esperando cinco segundos, y tomando una instantánea de la lengua después de cada paso.
Para determinar el módulo de compresibilidad del área, y la tensión y la tensión de la lysis continúan aumentando la presión de aspiración de 0,5 milinuevos por metro hasta alcanzar la tensión de ruptura. En este experimento representativo, el módulo de compresión de área y la cepa de lysis para POPC estaban en perfecto acuerdo con lo esperado de la literatura. En esta tabla se pueden observar valores típicos para los polímeros obtenidos.
Tenga en cuenta que la dureza de la membrana obtenida de copolímeros diblock es mucho mayor que la obtenida del copolímero tribloque. Curiosamente, utilizando el copolímero diblock, es posible obtener un líbrimo de polímero unilamilar híbrido gigante vesículas que demuestran una dureza más robusta que la medida para los liposomas. Este protocolo puede ser útil para medir la vesícula con una pipeta, por ejemplo, para medir la permeabilidad de la membrana a través de choque asmático.
Asegúrese de completar cada paso con rigor y precisión, especialmente al configurar la conexión tribuna. Esta técnica ha sido aprovechada para entender el origen físico de la fisión de la membrana, a través de la medición de la tensión de la línea en los límites principales en las vesículas modificadas.
