Bu protokol, mikropipet aspirasyon tekniği kullanılarak sentetik ve gerçek polimer lipid vezikülmembran mekanik özelliklerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesini kolaylaştırmaktadır. Bu, membran esnekliği ve kararsızlığının tek deneylerde değerlendirilmek üzere gerilmesine izin veren tek tekniktir. Bu protokol vezikül hazırlığından mekanik değerlendirmeye kadar bir dizi prosedür içerir.
Sabırlı olmak ve ortaya çıkan her türlü teknik sorunu çözmek çok önemlidir. Bu teknikler üzerinde görselleştirme nasıl düzgün kılcal yüzey tedavi ve nasıl zorunlu prestress adım gerçekleştirmek için anlamak için önemlidir. Vezikül'ün hatasız ortaya çıkmasın.
Gösterme prosedürü Martin Fauquignon, laboratuvar hibrid polimer lipid veziküllerin geliştirilmesi üzerinde çalışan bir doktora öğrencisi olacaktır. İşleme başlamadan önce soğuk cam mikropipet kılcal damarları dikey olarak tutuculara yerleştirin. Ve ipuçları bir gecede taze hazırlanmış glikoz sığır serum albumin çözeltisi batırılır kadar sahipleri düşürün.
Ertesi sabah çözelti kılcal eylem ile ipuçları içine yaklaşık bir santimetre artmış olmalıdır. Esnek erimiş silika kılcal damar ile donatılmış 500 mikrolitrelik cam şırınga kullanarak, glikoz çözeltisi ile her pipet doldurun. Daha sonra her pipetten çözeltiyi aspire edin, pipetleri taze glikoz solüsyonu yla doldurmadan önce serumun tamamı çıkarılıncaya kadar birkaç kez.
Bir elektroformasyon odası hazırlamak için, ilk uygun organik çözücü ile ITO slaytlar temiz ve bir Ohmetre ile iletken yüzeyi belirlemek. Yapışkan bantla her slaydın iletken tarafına elektrik telleri takın. Çözeltinin yaklaşık 5 mikrolitre kılcal eylem tarafından toplanana kadar ampivial çözelti içine bir kılcal daldırma.
Yüklü kılcal damarı bir cam ITO plakasının ortasına yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça slayta doğru yayın. Çözücü tamamen buharlaştığında, çözeltiyi az önce gösterildiği gibi iki kez daha uygulayın. biriktirme alanı etrafında açılan O-ring spacer her iki tarafında silikonsuz gres tabakası eklemeden önce.
Daha sonra, ikinci bir ITO cam plakanın iletken yüzünü boşluk tabakasının üstüne yerleştirin ve elektroformasyon odasını 3 saat vakum altına yerleştirin ve organik çözücü izlerini giderin. Dev Unilamellar Veziküllerin elektroformasyonu için elektrik kablolarını jeneratöre takın. Jeneratör frekansını 10 Hertz'e, genliğini 2 Volt'a ayarlayın.
Voltaj ayarlandığında, 0,8 milimetrelik iç çaplı iğneyle donatılmış bir şırınga kullanarak hazneye 0,1 molar sakaroz çözeltisi mililitre enjekte edin ve odayı uygulanan voltaj ve frekansın altında 75 dakika bekletin. Elektroformasyonun sonunda jeneratörü kapatın. Ve bir mililitreşşonu kullanarak odanın içinde bir hava kabarcığı üretilene kadar küçük bir çözelti hacmini aspire edin.
Kabarcığı odaya taşımak ve veziküllerin slayt yüzeyinden ayrılmasına yardımcı olmak için odayı hafifçe yatırın. Ve çözeltinin tüm hacmini şırıngaya aspire edin. Sonra, bir mililitreplastik tüp içine vezikül çözeltisi aktarın.
Mikromanipülasyon için malzeme kurmak için, bir su akışı oluşturmak için aspire, saf su tankı, bir tutucu. Ve herhangi bir hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için tankı yükseltirken hafifçe dokunun, ve pozitif basınç oluşturmak için. Ucunda bir damla oluşana kadar taze glikoz çözeltisi ile serum kaplı kılcal doldurun.
Tutucunun sonunda hafif bir su akışı oluşturmak için şırınga boruyu metal tutucudan çıkarın ve glikoz damlasını su akışına bağlamak için kılcal damarı ters çevirin. Sonra, kılcal ve tutucuyu birbirine vidalayın. Pipeti konumlandırmak için, vakum gresi ile birlikte özel yapım alüminyum sahneden iki cam slayt tutkal.
Ve slaytları mikroskop aşamasına töyorum. Bir mililitrelik pipet kullanarak, 0.1 molar glikoz ile iki slayt arasında bir menisküs oluşturur. Pipeti ve tutucuyu mikromanipülatörün motor ünitesine yerleştirin.
Sıkma tonunu sıkın ve kontrol paneli joystick'ini kaba modda kullanın. Glikoz menisküs yakın mikropipet indirin. Menisküs merkezine ucun konumunu ayarlamak için ince modu kullanın.
Dış ve iç yüzeyleri temizlemek için glikoz ucu batırın. Birkaç dakika sonra, menisküs kılcal geri çekin ve taze bir menisküs ile glikoz değiştirin. 20 mililitrelik mikropipet ucuna 0,1 azı sakaroziçinde iki mikrolitre Dev Unilamellar Vezikülasi aspire edin.
Vezikülleri menisküse sok. Slayt odasının altındaki vezikülleri gözlemlemek için mikroskobu kullanın. Veziküller hafifçe söndüğünde, emme pipetini yeniden takın ve pipetin ucuna odaklanın.
Daha sonra su tankının taban çizgisi yüksekliğini parçacıkların hareketinin durdurulduğu basınca ayarlayın. Buharlaşmayı önlemek için menisküsleri mineral yağile çevreleyin. Bir mikropipet aspirasyon deneyi yapmak için, pipet ucunu menisküsiçine indirin.
Bir vezikül aspire emme basıncı küçük bir miktar oluşturun. Seçilen vezikül membranı hafifçe dalgalanmalı ve görünür bir kusur bulunmamalıdır. Diğer veziküllerden aspire vezikül izole etmek için pipet daha yüksek bir seviyeye yükseltmek için mikromanipülatör kullanın.
Suyu yaklaşık 10 santimetreye düşürerek vezikülün ilk değerine geri döndürmek için tankı yükseltmeden önce veziküle uygulayın. 0,5 santimetre yükseklikten, membranın dalgalandığı bir basınca kadar emme basıncını yavaşça düşürün. Sonra açıkça ucu, birkaç mikron projeksiyon uzunluğu bir dil görselleştirmek için basıncı artırmak.
Bükme modülbelirlemek için, emiş basıncını artırın, adım adım bir şekilde bir seferde bir mikrometre. Metre başına 0,5 ila 0,8 miliNewton'a ulaşıncaya kadar. Beş saniye beklemek ve her adımdan sonra dilin fotoğrafını çekmek.
Alan sıkıştırılabilirlik modülasyon belirlemek için, ve lysis gerginlik ve gerinim kopma gerilimi ulaşılıncaya kadar metre başına 0,5 miliNewton'dan emme basıncını artırmaya devam eder. Bu temsili deneyde POPC için alan sıkıştırılabilirlik modülü ve lysis zorlanma literatürden beklenen ile mükemmel bir uyum vardı. Bu tabloda elde edilen polimeromlar için tipik değerler gözlemlenebilir.
Diblok kopolimerlerden elde edilen membranın tokluğunun triblok kopolimerden elde edilenlerden çok daha büyük olduğunu unutmayın. İlginçtir, diblock kopolimer kullanarak, bir Dev Hibrid Unilamilar Lipid Polimer Veziküller elde etmek mümkündür lipozomlar için ölçülen daha sağlam bir tokluk göstermek. Bu protokol, örneğin asmatik şok yoluyla membranın geçirgenliğini ölçmek için bir pipet ile vezikülölçümü için yararlı olabilir.
Özellikle tribün bağlantısını kurarken her adımı titizlik ve hassasiyetle tamamladığınızdan emin olun. Bu teknik, modifiye veziküllerde ana sınırlardaki çizgi geriliminin ölçülmesi yoluyla membran fizyonunun fiziksel kökenini anlamak için kullanılmıştır.
