פרוטוקול זה מאפשר מדידה אמינה של תכונות מכניות קרום של ורירית שומנים פולימרית סינתטית ואמתית באמצעות טכניקת שאיפה micropipette. זוהי הטכניקה היחידה המאפשרת גמישות קרום וחוסר יציבות להיות מתוח להיות מוערך בניסויים בודדים. פרוטוקול זה כרוך בסדרה של הליכים מהכנה קשה להערכה המכנית.
חשוב מאוד להיות סבלניים ולפתור בעיות טכניות כפי שהם מתעוררים. הדמיה על טכניקות אלה היא קריטית להבנת כיצד לטפל כראוי את פני השטח נימי וכיצד לבצע את הצעד prestress חובה. מראה את הווסקל ללא פגמים.
הליך ההדגמה יהיה מרטין Fauquignon, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה עובד על הפיתוח של ורי השומנים פולימר היברידית. לפני תחילת ההליך למקם נימים micropipette זכוכית קרה אנכית לתוך המחזיקים. ומנמיכים את המחזיקים עד שהטיפים שקועים בתספורת אלבומין בסרום גלוקוז טרי מוכנה בן לילה.
למחרת בבוקר הפתרון היה צריך לעלות על סנטימטר אחד לתוך הטיפים על ידי פעולה נימי. בעזרת מזרק זכוכית 500 מיקרוליטר, המצויד בנימים גמישים של סיליקה מותכת, ממלאים כל פיפטה בתתבנת הגלוקוז. לאחר מכן שאף את הפתרון מכל פיפטה, לפני מילוי פיפטות עם פתרון גלוקוז טרי מספר פעמים עד כל הסרום כפי שהוסר.
כדי להכין תא אלקטרופורמציה, ראשית לנקות ITO מחליק עם ממס אורגני מתאים, ולזהות את המשטח מוליך עם Ohmeter. חבר חוטי חשמל לצד ה מוליך של כל שקופית עם סרט דבק. טובלים נימי אחד בתסכום אמפיבי עד לכ-5 מיקרוליטרים של הפתרון נאסף על ידי פעולה נימית.
מניחים את נימי טעון במגע עם מרכז צלחת ITO זכוכית אחת בעדינות להפיץ את הפתרון על פני השקופית. כאשר הממס התאדה לחלוטין, להחיל את הפתרון פעמיים נוספות כפי שהוכח רק. לפני הוספת שכבה של שומן ללא סיליקון משני צידי המרחב O-ring שנפתח סביב שטח התצהיר.
לאחר מכן, מניחים את הפנים מוליך של צלחת זכוכית ITO שנייה על החלק העליון של המרחב, וממקמים את תא האלקטרופורמציה תחת ואקום במשך 3 שעות כדי להסיר כל עקבות של ממס אורגני. לקבלת האלקטרופורמציה של וריקלים יונימלריים ענקיים, חבר את החוטים החשמליים לגנרטור. הגדר את תדר הגנרטור ל-10 הרץ, ואת משרעת ל-2 וולט, שיא לשיא.
כאשר המתח נקבע, השתמש במזרק המצויד במחט בקוטר פנימי של 0.8 מילימטר כדי להזריק מיליליטר אחד של תוסף סוכרוז טוחנת 0.1 לתא, ולהשאיר את התא מתחת למתח ולתדירות המוחלים למשך 75 דקות. בסוף האלקטרופורמציה, כבה את הגנרטור. ולהשתמש במזרק מיליליטר אחד כדי לשאוף נפח קטן של פתרון עד בועת אוויר מיוצר בתוך התא.
להטות את התא מעט כדי להזיז את הבועה לתוך התא, ולעזור veים להתנתק מפני השטח של השקופית. ושאוף את כל נפח הפתרון למזרק. לאחר מכן, להעביר את הפתרון קשה לתוך צינור פלסטיק מיליליטר אחד.
כדי להקים את החומרים עבור micromanipulation, שאף כדי ליצור זרימת מים, מיכל של מים טהורים, למחזיק אחד. והקש קלות תוך כדי הרמת הטנק כדי לחסל את כל בועות האוויר, וליצור לחץ חיובי. ממלאים נימי מצופה בסרום בתספורת גלוקוז טרי עד שנוצרת טיפה בקצה.
מוציאים את צינורות המזרק ממחזיק המתכת כדי ליצור זרימת מים קלה בקצה המחזיק, ולהפוך את נימי במהופך כדי לחבר את טיפת הגלוקוז לזרימת המים. לאחר מכן, לדפוק את נימי ואת המחזיק יחד. כדי למקם את פיפטה, הדבק שתי שקופיות זכוכית מתוך שלב אלומיניום בהתאמה אישית יחד עם שומן ואקום.
ולהתקין את השקופיות על שלב מיקרוסקופ. באמצעות פיפיאט מיליליטר אחד, טופס מניסקוס בין שתי השקופיות עם 0.1 גלוקוז טוחן. מניחים את הפיפיט והמחזיק שלו על יחידת המנוע של המיקרומניפולטור.
הדקו את כפתור ההידוק, ולהשתמש בג'ויסטיק של לוח הבקרה במצב גס. מנמיך את המיקרופיט ליד מניסקוס הגלוקוז. השתמש במצב עדין כדי להתאים את המיקום של הקצה למרכז המניסקוס.
טובלים את הקצה בגלוקוז כדי לנקות את המשטחים החיצוניים והפנימיים שלו. לאחר מספר דקות, מוציאים את נימי המניסקוס ומחליפים את הגלוקוז במניסקוס טרי. שאפו שני מיקרוליטרים של ורי ורי ענק של יונימלר בסוקרוז טוחנת 0.1, לקצה מיקרופיפט של 20 מיליליטר.
הציגו את הווסיקים לתוך המניסקוס. השתמש במיקרוסקופ כדי להתבונן בווסיקלים בתחתית תא השקופיות. כאשר הווסיקלים מנוכרים מעט, יש להחזיר את פיפט היניקה ולהתמקד בקצה הפיפטה.
לאחר מכן הגדר את הגובה הבסיסי של מיכל המים ללחץ שבו תנועת החלקיקים נעצרת. הקיפו את המניסקוס בשמן מינרלי כדי למנוע אידוי. כדי לבצע ניסוי שאיפה micropipette, להוריד את קצה פיפטה לתוך המניסקוס.
צור כמות קטנה של לחץ יניקה כדי לשוכם יצור. קרום הווסקל שנבחר צריך להשתנות מעט ולא צריך להציג פגמים גלויים. השתמש במיקרומניפולטור כדי להעלות את הפיפטה לרמה גבוהה יותר כדי לבודד את הווסקל שאפתן משאריות אחרות.
מנמיכים את מיכל המים לכ-10 ס"מ כדי לקדם את הווסקל לפני הרמת המיכל כדי להחזיר את הלחץ לערך הראשוני. מגובה של 0.5 ס"מ, לאט לאט להקטין את לחץ היניקה עד לחץ שבו תנודות הממברנה הוא הגיע. ואז להגביר את הלחץ כדי לדמיין בבירור לשון בקצה, אורך ההקרנה של כמה מיקרון.
כדי לקבוע את מודולוס כיפוף, להגדיל את לחץ היניקה, מיקרומטר אחד בכל פעם באופן צעד אחר צעד. עד 0.5 עד 0.8 מיליטון למטר הוא הגיע. מחכה חמש שניות, ומצלם תמונה של הלשון אחרי כל צעד.
כדי לקבוע את מודולוס דחיסת האזור, מתח תזה ומתח ממשיכים להגביר את לחץ היניקה מ 0.5 מיליNewtons למטר עד המתח קרע הוא הגיע. בניסוי מייצג זה מודולוס דחיסת שטח זן תזה עבור POPC היו בהסכמה מושלמת עם זה צפוי מן הספרות. בטבלה זו ניתן לראות ערכים אופייניים לפולימרסומים המתקבלים.
שים לב כי הקשיחות של הממברנה המתקבלת קופולימרים diblock הוא הרבה יותר גדול מאלה המתקבלים קופולימר טריבלוק. מעניין, באמצעות קופולימר דיבלוק, ניתן להשיג ענק היברידית יונימיליאר ליפיד פולימר Vesicles להפגין קשיחות חזקה יותר מזה נמדד ליפוזומים. פרוטוקול זה יכול להיות מועיל למדידת וריחיים עם פיפטה, למשל, כדי למדוד את חדירות הממברנה באמצעות הלם אסמטי.
הקפד להשלים כל שלב בקפדנות ובדיוק, במיוחד בעת הגדרת חיבור הטריביון. טכניקה זו נוצל כדי להבין את המקור הפיזי של ביקוע קרום, באמצעות מדידת מתח קו בגבולות העיקריים קשה שונה.
