يوفر هذا البروتوكول أساليب قياسية وقابلة للتكرار لتقييم الاستجابات الدوائية في الثقافات العضوية في البروستاتا. الثقافات العضوية البروستاتا توفير نظام في المختبر الذي يحافظ على جوانب كثيرة في علم الأحياء في الجسم الحي والاستجابة الدوائية من خلال السماح للخلايا لاعتماد هيكل ثلاثي الأبعاد في مصفوفة غشاء الطابق السفلي. نحن متحمسون بشكل خاص حول استخدام هذه الطرق لتقييم كيف يملي النمط الجيني الاستجابة الدوائية في البروستاتا والنمذجة مقاومة الدواء.
يمكن تطبيق هذه الطرق على أنظمة الثقافة العضوية التي تستخدم طريقة طلاء القبة. ومع ذلك، قد تختلف المكونات في وسائل الإعلام مثل عوامل النمو تبعا لنوع الأنسجة. وسيتيح العرض التوضيحي المرئي إجراء مناقشة أكثر تحديدا وتفصيلا للخطوات البروتوكولية وكيفية اختلافها عن العديد من نظم الثقافة العضوية المنشورة الأخرى المتاحة للباحثين.
عادةً ما تكون الثقافة العضوية أكثر استهلاكًا للوقت من ثقافة الخلايا الثنائية الأبعاد. تأكد من تخصيص وقت إضافي لهذه الطرق. ابدأ بعزل الأعضاء في البروستاتا عن الفأر أو الأنسجة البشرية.
المفروم وهضم الانزيمية الأنسجة لإنتاج تعليق خلية واحدة، ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق. عد الخلايا وإعادة تعليقها في مصفوفة غشاء الطابق السفلي. ثم لوحة لهم في الكثافة المناسبة في القباب المصفوفة على لوحات ثقافة organoid قبل الدافئة.
يجب أن تكون القباب مليمترين بعيدًا عن بعضها البعض ومن جانب البئر. بمجرد توطد، إضافة بلطف وسائل الإعلام من جانب البئر لتجنب تعطيل المصفوفة. بعد أن تتوطد القباب، أضف وسائل الإعلام فوق القبة بحيث يتم تغطيتها بالكامل.
زيادة الأعضاء إلى الكمية المطلوبة لتطبيقات المصب تحديد عدد الخلايا مع أساليب العد القياسية. عندما تكون organoids جاهزة للاستخدام، رسم المتوسطة مع ماصة Pten00 وماصة لأعلى ونسف لتعطيل مصفوفة غشاء الطابق السفلي. نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وطاردة مركزية في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق.
استلهمت من فوق ونغسل بيليه الخلية بخمسة ملليلترات من برنامج تلفزيوني. كرر الطرد المركزي، ثم إعادة تعليق بيليه في أربعة ملليلتر من استبدال التربسين والسماح لها الهضم لمدة خمس إلى 10 دقائق في حين تهتز في 37 درجة مئوية. إضافة حجم مساو من المتوسطة organoid مع 10٪ FBS لمنع استبدال التربسين والطرد المركزي الأنبوب في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق.
التعرق و resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. ثم سلالة الخلايا مع مرشح 40 ميكرومتر لضمان تعليق خلية واحدة وعدها باستخدام مقياس الهيموسيت. تخفيف تعليق الخلية إلى 100 خلية لكل 10 ميكرولترات باستخدام المتوسطة organoid مع 10 ميكرومولار rho كيناز المانع Y27632.
نقل 1، 100 خلية إلى أنبوب مخروطي جديد وإضافة 285 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي مما سيؤدي إلى تركيز مصفوفة 70٪. بعد ذلك ، بذور الخلايا في 35 ميكرولترات من القباب مصفوفة في لوحة 24 جيدا قبل الدافئة مع التأكد من لوحة ثلاثة إلى خمسة يكرر لكل عينة. الوجه لوحة ووضعها في حاضنة الخلية لترسيخ مصفوفة الطابق السفلي.
بعد 10 دقائق، قم بإزالة الطبق من الحاضنة وأضف وسيطًا يحتوي على مثبطات rho kinase. تحديث المتوسطة كل يومين وبعد سبعة أيام، عد عدد organoids المنشأة لكل قبة وحساب نسبة من organoids شكلت من العدد الإجمالي للخلايا. بعد عزل organoids كما وصف سابقا ، بذرة 1، 000 إلى 10، 000 الخلايا في قبة مصفوفة باستخدام كفاءة تشكيل organoid وسرعة النمو كوكيل لتحديد عدد الخلايا النهائية.
ثم البذور 35 ميكرولترات من القباب مصفوفة في لوحة 24 جيدا والسماح للقبة ترسيخ. إضافة المتوسطة التي تحتوي على مثبطات كيناز rho والدواء المفضل. تنفيذ سجل 10 تدريجية لتحديد تركيز مثبطة القصوى نصف باستخدام السيارة التي تم حل الدواء كتحكم.
قم بتحديث الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام وتحليل الأعضاء في اليوم السابع لتحديد الاستجابة الدوائية للدواء من خلال إجراء فحص الخلية على النحو المبين في المخطوطة. لوحة شظايا organoid دون تريبسينيمنت، استخدام ماصة Pten00 لpirate المتوسطة والماصات صعودا وهبوطا لتعطيل مصفوفة غشاء الطابق السفلي. عندما يتم تعطيل المصفوفة بشكل كامل، نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر والطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق.
استلهموا المُتطّر وأضيفوا خمسة ملليلترات من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل ، resuspend organoids في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وتعطيل organoids عن طريق التثلث مع ماصات باستور الزجاج. كمّيّة العدد من شظايا عضويّة وبذات خمسة ينسخ مع 100 شظايا بما أنّ سابقا وصف.
سبعة أيام في وقت لاحق، إجراء الخلية قابلية البقاء وفقا لاتجاهات المخطوطات. أظهرت الخلايا القاعدية البرية من النوع البروستاتا تكويناً عضوياً فائقاً مقارنة بالخلايا الإنارة. وتحققت زيادة طفيفة في تشكيل الجهاز مع CRISPR-Cas9 بوساطة خسارة Pten أو P53 وفقدان كل من زيادة قدرة التكوين.
تم اختبار آثار الجزيئات المضادة للاندروجين على النمو في العضيات المورين مع أنواع وراثية مختلفة. فقدان P53 لم يسبب مقاومة للجزيئات المضادة للاندروجين، ولكن فقدان Pten زيادة المقاومة. ومع ذلك، أدى فقدان مزدوج من P53 وPten، في مقاومة كاملة.
كما غيّر تثبيط مستقبلات الاندروجين الأنماط الظاهرية. نوع البرية Pten حذف وP53 حذف organoids أظهرت انخفاض في حجم التجويف organoid بينما organoids مع فقدان كل من Pten وP53 كانت غير متأثرة بشكل ظاهري. كما هو متوقع، عندما كانت هذه الخلايا المطعمة تحت الجلد في الجناح، فقط مزدوجة حذف Pten وP53 organoids نمت.
تم اختبار اثنين متميزين من سرطان البروستاتا البشري MSKPCA2 وMSKPCA3 لاستجابتهما للجزيئات المضادة للاندروجيني. تم منع انتشار أعضاء MSKPCA2 بشدة في حين أن أعضاء MSKPCA3 ظلت غير متأثرة. MSKPCA2 أعرب عن مستويات عالية من مستقبلات الاندروجين وFKBP5 وكذلك البروتينات المميزة.
MSKPCA3 أعرب أيضا عن علامات القاعدية والمينشيمال وأظهرت أي تعبير عن FKBP5 مما يشير إلى أن هذه organoids نموذج ظاهري غير الاندروجين مستقل. وينبغي تعطيل الأجهزة العضوية دوريا إما عن طريق التربسينيشن أو التثايب بمواصة زجاجية لكي تظل قابلة للحياة. يعتمد التردد على أصل الأنواع والنمط الجيني.
يمكن تنفيذ أي نوع من الجيل التالي من التسلسل أو تجربة البروتيوميكس بعد الإجراءات الموضحة. هذه التجارب سوف تحقق الأساس الجزيئي للنمط الظاهري والاستجابات الدوائية. تسمح تقنية الثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد هذه للباحثين بدراسة الاستجابات الدوائية في سياق وراثي مسيطر عليه للغاية في المختبر.
هذا يمكن أن يكون بديلا موثوقا به لفترة طويلة في الدراسات الحية.
