Этот протокол предоставляет стандартные и воспроизводимые методы оценки фармакологических реакций в органоидных культурах простаты. Органоидные культуры простаты обеспечивают систему in vitro которая сохраняет много аспектов биологии in vivo и фармакологического ответа путем позволять клеткам принять трехмерную структуру в матрице мембраны подвала. Мы особенно рады использовать эти методы для оценки того, как генотип диктует фармакологические реакции в предстательной железе и модели лекарственной устойчивости.
Эти методы могут быть применены к системам органоидной культуры, которые используют метод обливания купола. Тем не менее, компоненты в средствах массовой информации, такие как факторы роста могут отличаться в зависимости от типа тканей. Визуальная демонстрация позволит более конкретно и подробно обсудить шаги протокола и то, чем они отличаются от многих других опубликованных систем органоидной культуры, доступных исследователям.
Органоидная культура, как правило, занимает больше времени, чем двухмерная культура клеток. Не забудьте выделить дополнительное время для этих методов. Начните с изоляции органоидов простаты от мыши или человеческой ткани.
Фарш и enzymatically переварить ткани производить одноклеточную подвеску, а затем собирать клетки центрифугации в 300 раз г в течение пяти минут. Подсчитайте клетки и повторно посчитайте их в мембранной матрице подвала. Затем пластины их при соответствующей плотности в матричных куполах на предварительно разогретых органоидных пластин культуры.
Куполы должны быть на два миллиметра друг от друга и со стороны колодец. После затвердевания, аккуратно добавить средства массовой информации со стороны хорошо, чтобы избежать нарушения матрицы. После того, как купола затвердеют, добавьте средства массовой информации на верхней части купола так, чтобы они были полностью покрыты.
Выращиваем органоиды до нужного количества для приложений ниже по течению, определяющих номер клетки стандартными методами подсчета. Когда органоиды готовы к использованию, составить среду с Pten00 пипетки и пипетки его вверх и вниз, чтобы нарушить мембрану подвала матрицы. Перенесите суспензию в 15 миллилитровую коническую трубку и центрифугу при 300 раз г в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант и мыть гранулы клеток с пятью миллилитров PBS. Повторите центрифугации, затем повторно гранулы в четыре миллилитров трипсина замены и дайте ему переварить в течение пяти до 10 минут при встряхивании при 37 градусов по Цельсию. Добавьте равный объем органоидной среды с 10%FBS, чтобы ингибировать замену трипсина и центрифугировать трубку при 300 раз g в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант и повторно помыть клетки в один миллилитр PBS. Затем процедите клетки с помощью 40-метрового фильтра, чтобы обеспечить одноклеточную подвеску и посчитать их с помощью гемоцитометра. Разбавить клеточной суспензией до 100 клеток на 10 микролитров с помощью органоидной среды с 10 микромолейными ингибиторами киназы Y27632.
Перенесите 1 100 клеток в новую коническую трубку и добавьте 285 микролитров мембранной матрицы подвала, что приведет к 70%-ной концентрации матрицы. Далее, семена клеток в 35 микролитров матричных куполов в предварительно разогретой 24 хорошо пластины убедившись, что пластина от трех до пяти репликаций на образец. Переверните пластину и поместите ее в клеточный инкубатор, чтобы укрепить подвальные матрицы.
Через 10 минут снимите пластину с инкубатора и добавьте среду, содержащую ингибитор родиазы. Обновляйте среду каждые два дня и через семь дней, подсчитывайте количество органоидов, установленных на купол, и вычисляйте процент органоидов, образованных из общего количества клеток. После изоляции органоидов, как описано ранее, семя от 1000 до 10 000 клеток в матричном куполе, используя эффективность органоидного образования и скорость роста в качестве прокси для определения окончательного числа клеток.
Затем семя 35 микролитров матричных куполов в 24 хорошо пластины и пусть купол затвердеть. Добавьте среду, содержащую ингибитор родиазы и препарат выбора. Выполните журнал 10 дополнительных определить половину максимальной ингибирующей концентрации с помощью транспортного средства, в котором препарат был растворен в качестве контроля.
Освежите среду каждые два-три дня и проанализируйте органоиды на седьмой день, чтобы определить фармакологическую реакцию на препарат, выполняя анализ жизнеспособности клеток, описанный в рукописи. Для пластины органоидных фрагментов без трипсинизации, используйте Pten00 пипетку, чтобы аспирировать средний и пипетки вверх и вниз, чтобы нарушить матрицу мембраны подвала. Когда матрица полностью нарушена, перенесите подвеску на 15 миллилитровую коническую трубку и центрифугу при 300 раз г в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант и добавить пять миллилитров PBS. После мытья, resuspend органоидов в один миллилитр PBS и нарушить органоидов путем тритурации со стеклом Пастер пипетки. Количественная оценка количества фрагментов органоидов и семян пять реплицирует с 100 фрагментов, как описано ранее.
Семь дней спустя выполните анализ жизнеспособности клеток в соответствии с рукописными указаниями. Дикие типы базальных клеток простаты продемонстрировали превосходное органоидное образование по сравнению с светящимися клетками. Незначительное увеличение органоидного образования было достигнуто с CRISPR-Cas9-опосредованная потеря Pten или P53 и потеря как дальнейшего увеличения потенциала формирования.
Влияние антиандрогенных молекул на рост было протестировано в муриновых органоидах с различными генотипами. Потеря P53 не вызывает резистентности к антиандрогенным молекулам, но потеря Pten повышенной резистентности. Двойная потеря P53 и Pten, однако, привела к полному сопротивлению.
Ингибирование рецепторов андрогенов также изменило фенотипы. Дикий тип Pten удалены и P53 удаленных органоидов продемонстрировали снижение размера органоидного люмена в то время как органоиды с потерей как Pten и P53 были фенотипически не затронуты. Как и ожидалось, когда эти клетки были привиты подкожно на фланге, только двойной удаленЫ Pten и P53 органоиды выросли.
Два различных органаоидов рака предстательной железы человека MSKPCA2 и MSKPCA3 были протестированы на их реакцию на антиандрогенные молекулы. Распространение органоидов MSKPCA2 было сильно ингибировано, в то время как органоиды MSKPCA3 оставались без изменений. MSKPCA2 выразил высокий уровень рецепторов андрогенов и FKBP5, а также отличительные светящиеся белки.
MSKPCA3 также выразил базальные и мезенхимальные маркеры и не показал выражение FKBP5 предполагая, что эти органоиды модели не-люминесцентных андрогенов независимого фенотипа. Органоиды должны периодически нарушаться либо путем трипсинизации, либо путем тритурации стеклянной пипеткой, чтобы оставаться жизнеспособными. Частота зависит от происхождения вида и генотипа.
Любой тип секвенирования следующего поколения или эксперимент протеомики может быть выполнен после описанных процедур. Эти эксперименты будут исследовать молекулярную основу фенотипов и фармакологических реакций. Этот трехмерный метод органоидной культуры позволяет исследователям изучать фармакологические реакции в высоко контролируемом генетическом контексте in vitro.
Это может быть надежной альтернативой длительным исследованиям in vivo.
