Este protocolo fornece métodos padrão e reprodutíveis para avaliar respostas farmacológicas em culturas organoides de próstata. As culturas organoides da próstata fornecem um sistema in vitro que preserva muitos aspectos da biologia in vivo e da resposta farmacológica, permitindo que as células adotem uma estrutura tridimensional em uma matriz de membrana de porão. Estamos particularmente entusiasmados com o uso desses métodos para avaliar como o genótipo dita a resposta farmacológica na próstata e para modelar a resistência medicamentosa.
Esses métodos podem ser aplicados a sistemas de cultura organoide que usam o método de revestimento de cúpula. No entanto, os componentes da mídia, como fatores de crescimento, podem diferir dependendo do tipo de tecido. A demonstração visual permitirá uma discussão mais específica e detalhada das etapas do protocolo e como elas diferem dos muitos outros sistemas de cultura organoide publicados disponíveis aos pesquisadores.
A cultura organoide é tipicamente mais demorada do que a cultura celular bidimensional. Certifique-se de alocar tempo extra para esses métodos. Comece isolando organoides de próstata de camundongos ou tecido humano.
Mince e enzimaticamente digerem o tecido para produzir uma única suspensão celular, em seguida, coletar as células por centrifugação a 300 vezes g durante cinco minutos. Conte as células e repusam-as na matriz de membrana do porão. Em seguida, emplaque-os na densidade apropriada nas cúpulas matriciais em placas de cultura organoide pré-aquecidas.
As cúpulas devem estar a dois milímetros uma da outra e do lado do poço. Uma vez solidificado, adicione suavemente a mídia do lado do poço para evitar interromper a matriz. Depois que as cúpulas se solidificarem, adicione mídia em cima da cúpula para que elas estejam completamente cobertas.
Cresça organoides à quantidade desejada para aplicações a jusante determinando o número celular com métodos de contagem padrão. Quando os organoides estiverem prontos para usar, elabore o meio com uma pipeta Pten00 e pipeta para cima e para baixo para interromper a matriz de membrana do porão. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros e centrífuga a 300 vezes g durante cinco minutos.
Aspire o supernasce e lave a pelota celular com cinco mililitros de PBS. Repita a centrifugação, depois resuspenda a pelota em quatro mililitros de substituição de trippsina e deixe digerir por cinco a 10 minutos enquanto treme a 37 graus Celsius. Adicione um volume igual de meio organoide com 10% FBS para inibir a substituição da trippsina e centrifugar o tubo a 300 vezes g durante cinco minutos.
Aspire o supernasce e resuspend as células em um mililitro de PBS. Em seguida, coe as células com um filtro de 40 micrômetros para garantir a suspensão de célula única e conte-as usando um hemótmetro. Diluir a suspensão celular para 100 células por 10 microliters usando meio organoide com 10 micromolar rho kinase inibidor Y27632.
Transfira 1.100 células para um novo tubo cônico e adicione 285 microliters de matriz de membrana de porão que resultará em uma concentração matricial de 70%. Em seguida, semeou as células em 35 microliters de cúpulas matriciais em uma placa pré-aquecida de 24 poços certificando-se de emplacar três a cinco réplicas por amostra. Vire a placa e coloque-a em uma incubadora celular para solidificar a matriz do porão.
Após 10 minutos, retire a placa da incubadora e adicione o meio contendo o inibidor de rho quinase. Refrescar o meio a cada dois dias e após sete dias, contar o número de organoides estabelecidos por cúpula e calcular a porcentagem de organoides formados do número total de células. Depois de isolar os organoides como descrito anteriormente, a semente 1.000 a 10.000 células na cúpula matricial usando eficiência de formação organoide e velocidade de crescimento como proxy para determinar o número de células finais.
Em seguida, semente 35 microliters de cúpulas matriciais em uma placa de 24 poços e deixar a cúpula solidificar. Adicione o meio contendo o inibidor de rho quinase e a droga de escolha. Realize um registro 10 incremental para determinar a concentração inibitória semi-máxima usando o veículo em que a droga foi dissolvida como controle.
Atualize o meio a cada dois ou três dias e analise os organoides no sétimo dia para determinar a resposta farmacológica à droga, realizando um ensaio de viabilidade celular, conforme descrito no manuscrito. Para emplacar fragmentos organoides sem trippsinização, use uma pipeta Pten00 para aspirar a pipeta média e pipeta para cima e para baixo para interromper a matriz de membrana do porão. Quando a matriz estiver totalmente interrompida, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros e centrífuga a 300 vezes g durante cinco minutos.
Aspire o supernasário e adicione cinco mililitros de PBS. Após a lavagem, resuspenque os organoides em um mililitro de PBS e interrompa os organoides por trituração com uma pipeta Pasteur de vidro. Quantifique o número de fragmentos organoides e cinco réplicas de sementes com 100 fragmentos como descrito anteriormente.
Sete dias depois, realize um ensaio de viabilidade celular de acordo com as instruções do manuscrito. Células basais de próstata do tipo selvagem demonstraram formação organoide superior em comparação com células luminais. Um pequeno aumento na formação organoide foi alcançado com a perda mediada pelo CRISPR-Cas9 de Pten ou P53 e perda de capacidade de formação ainda maior.
Os efeitos das moléculas anti-androgênicas no crescimento foram testados em organoides murinas com diferentes genótipos. A perda de P53 não causou resistência às moléculas anti-androgênicas, mas a perda de Pten aumentou a resistência. A perda dupla de P53 e Pten, no entanto, resultou em resistência completa.
A inibição do receptor andrógeno também alterou fenótipos. Tipo selvagem Pten excluído e organoides excluídos P53 demonstraram a diminuição do tamanho do lúmen organoide, enquanto organoides com perda de Pten e P53 foram fenotipicamente não afetados. Como esperado, quando essas células foram enxertadas subcutâneamente no flanco, apenas os organoides Pten e P53 duplamente excluídos cresceram.
Dois organoides distintos do câncer de próstata humano MSKPCA2 e MSKPCA3 foram testados para sua resposta a moléculas anti-androgênicas. A proliferação de organoides MSKPCA2 foi fortemente inibida, enquanto os organoides MSKPCA3 não foram afetados. MSKPCA2 expressou altos níveis de receptores de andrógeno e FKBP5, bem como proteínas luminais marcantes.
MSKPCA3 também expressou marcadores basais e mesenquimais e não mostrou nenhuma expressão de FKBP5 sugerindo que esses organoides modelam um fenótipo não luminal andrógeno independente. Os organoides precisam ser interrompidos periodicamente, seja por experimentação ou trituração com uma pipeta de vidro para permanecer viável. A frequência depende da origem das espécies e do genótipo.
Qualquer tipo de sequenciamento de próxima geração ou experimento de proteômica pode ser realizado após os procedimentos descritos. Esses experimentos investigariam a base molecular dos fenótipos e respostas farmacológicas. Esta técnica de cultura organoide tridimensional permite que os pesquisadores estudem respostas farmacológicas em um contexto genético altamente controlado in vitro.
Esta pode ser uma alternativa confiável para estudos in vivo demorados.
