Bu protokol, prostat organoid kültürlerinde farmakolojik yanıtları değerlendirmek için standart ve tekrarlanabilir yöntemler sağlar. Prostat organoid kültürleri, hücrelerin bir bazal membran matrisinde üç boyutlu bir yapıbenimsemelerine izin vererek in vivo biyoloji ve farmakolojik yanıtın birçok yönünü koruyan bir in vitro sistem sağlar. Özellikle bu yöntemleri kullanarak genotipin prostatta farmakolojik yanıtı nasıl belirlediğini değerlendirmek ve ilaç direncini modellemek için heyecanlıyız.
Bu yöntemler kubbe kaplama yöntemini kullanan organoid kültür sistemlerine uygulanabilir. Ancak, büyüme faktörleri gibi ortamdaki bileşenler doku tipine bağlı olarak farklılık gösterebilir. Görsel gösteri, protokol adımlarının ve bunların araştırmacıların kullanabileceği diğer yayınlanmış organoid kültür sistemlerinden nasıl farklı olduğu hakkında daha spesifik ve ayrıntılı bir tartışma sağlayacaktır.
Organoid kültür genellikle iki boyutlu hücre kültüründen daha fazla zaman alıcıdır. Bu yöntemler için ekstra zaman ayırmak için emin olun. Prostat organoidlerini fare veya insan dokusundan izole ederek başlayın.
Kıyma ve enzimatik tek bir hücre süspansiyon üretmek için doku sindirmek, daha sonra beş dakika boyunca 300 kez g santrifüj ile hücreleri toplamak. Hücreleri say ve bazal membran matrisinde tekrar askıya alın. Daha sonra önceden ısıtılmış organoid kültür plakaları üzerinde matris kubbeler uygun yoğunlukta plaka.
Kubbeler birbirinden iki milimetre uzakta ve kuyunun kenarından olmalıdır. Katılaştırıladıktan sonra, matrisi bozmamak için kuyunun yanından yavaşça ortam ekleyin. Kubbeler katıldıktan sonra kubbenin üzerine ortam ekleyin ki tamamen kaplanmış olacak şekilde.
Standart sayma yöntemleri ile hücre sayısını belirleyen downstream uygulamaları için organoidleri istenilen miktarda büyütün. Organoidler kullanıma hazır olduklarında, orta yı Pten00 pipetve pipetle yukarı aşağı çekilip bodrum membran matrisini bozun. Süspansiyonu 15 mililitrelik konik tüp ve santrifüje 300 kez g olarak beş dakika aktarın.
Supernatant aspire ve PBS beş mililitre ile hücre pelet yıkayın. Santrifüjtekrarlayın, sonra tripsin replasmanına dört mililitre pelet resuspend ve 37 santigrat derece sallayarak beş ila 10 dakika sindirimi için izin. Tripsin replasmanı inhibe etmek için %10 FBS ile eşit hacimli organoid ortam ekleyin ve tüpü 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin.
Supernatant aspire ve PBS bir mililitre hücreleri resuspend. Daha sonra hücreleri 40 mikrometrelik bir filtreyle zorlayarak tek hücresüspansiyonu sağlayın ve hemositometre kullanarak sayar. 10 mikromolar rho kinaz inhibitörü Y27632 ile organoid orta kullanarak 10 mikrolitre başına 100 hücre hücre süspansiyon seyreltin.
1, 100 hücreyi yeni bir konik tüpe aktarın ve %70 matris konsantrasyonuna neden olacak 285 mikrolitre bazal membran matris ekleyin. Daha sonra, hücreleri 35 mikrolitre matris kubbesi içinde önceden ısıtılmış 24 kuyu plakaiçinde tohumlayın ve numune başına 3-5 kopya yıkın. Plakayı çevirin ve bodrum matrisini sağlamlaştırmak için bir hücre kuvöze yerleştirin.
10 dakika sonra, kuvözden plakayı çıkarın ve rho kigaz inhibitörü içeren ortam ekleyin. Her iki günde bir ve yedi gün sonra ortamı yenileyin, kubbe başına kurulan organoid lerin sayısını sayın ve toplam hücre sayısından oluşan organoidlerin yüzdesini hesaplayın. Daha önce açıklandığı gibi organoidler izole sonra, tohum 1, 000 için 10, 000 hücreleri matris kubbe organoid oluşum verimliliği ve büyüme hızı kullanarak son hücre numarasını belirlemek için bir proxy olarak.
Daha sonra 24 kuyu plakalı 35 mikrolitre matris kubbe tohumu ve kubbe katılaşmak sağlar. Rho kigaz inhibitörü ve tercih edilen ilaç içeren orta ekleyin. Bir günlük 10 ilaç bir kontrol olarak çözüldü araç kullanarak yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu belirlemek için artımlı gerçekleştirin.
Her iki ila üç günde bir ortamı yenileyin ve yazıda açıklandığı gibi bir hücre canlılığı tsay yaparak ilaca farmakolojik yanıtı belirlemek için yedinci günde organoidleri analiz edin. Tripsinizasyon olmadan organoid parçaları plaka için, orta ve pipet yukarı ve aşağı bodrum membran matris bozmak için aspire bir Pten00 pipet kullanın. Matris tamamen bozulduğunda, süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe ve santrifüje 300 kez g'de beş dakika aktarın.
Supernatant aspire ve PBS beş mililitre ekleyin. Yıkamadan sonra, PBS bir mililitre organoidler resuspend ve cam Pasteur pipet ile triturasyon ile organoidler bozabilir. Organoid parçaların sayısını ve tohum beş çoğaltMa sayısını daha önce açıklandığı gibi 100 parça ile ölçün.
Yedi gün sonra, el yazması talimatlara göre bir hücre canlılık tayini yapın. Yabani tip prostat bazal hücreleri luminal hücrelere göre üstün organoid oluşumunu gösterdi. CRISPR-Cas9 aracılı Pten veya P53 kaybı ve her ikisinin de daha fazla oluşum kapasitesinin kaybı ile organoid formasyonda küçük bir artış sağlandı.
Anti-androjenik moleküllerin büyüme üzerindeki etkileri farklı genotiplere sahip murine organoidlerinde test edildi. P53 kaybı anti-androjenik moleküllere direnç neden olmadı, ancak Pten kaybı direnci arttı. Ancak Çift Etek P53 ve Pten kaybı tam dirençle sonuçlandı.
Androjen reseptör inhibisyonu da fenotipleri değiştirdi. Yabani tip Pten silinmiş ve P53 silinen organoidler organoid lümen boyutunda azalma gösterirken, hem Pten hem de P53 kaybı olan organoidler fenotipik olarak etkilenmedi. Beklendiği gibi, bu hücreler kanadında deri altı aşılandığında, sadece çift silinen Pten ve P53 organoidler büyüdü.
İki farklı insan prostat kanseri organoidleri MSKPCA2 ve MSKPCA3 anti-androjenik moleküllere yanıt için test edildi. MSKPCA2 organoidlerinin proliferasyonu güçlü bir şekilde inhibe edilirken, MSKPCA3 organoidleri etkilenmedi. MSKPCA2 androjen reseptörleri ve FKBP5 yanı sıra ayırt edici luminal proteinlerin yüksek düzeyde ifade.
MSKPCA3 ayrıca bazal ve mezenkimal belirteçleri ifade ve FKBP5 bu organoidler olmayan luminal androjen-bağımsız fenotip modeli düşündüren hiçbir ifade gösterdi. Organoidlerin canlı kalabilmeleri için düzenli olarak tripsinizasyon veya cam pipetle triturasyon ile bozulması gerekir. Frekans tür kökeni ve genotip bağlıdır.
Açıklanan yordamlar izleyerek her türlü yeni nesil sıralama veya proteomik deney yapılabilir. Bu deneyler fenotiplerin moleküler temelini ve farmakolojik yanıtları araştırır. Bu üç boyutlu organoid kültür tekniği araştırmacıların farmakolojik yanıtları in vitro olarak son derece kontrollü genetik bağlamda incelemelerine olanak sağlar.
Bu uzun in vivo çalışmalar için güvenilir bir alternatif olabilir.
