Este protocolo proporciona métodos estándar y reproducibles para evaluar las respuestas farmacológicas en cultivos organoides prostáticos. Los cultivos organoides de próstata proporcionan un sistema in vitro que preserva muchos aspectos de la biología in vivo y la respuesta farmacológica al permitir que las células adopten una estructura tridimensional en una matriz de membrana sótano. Estamos particularmente entusiasmados con el uso de estos métodos para evaluar cómo el genotipo dicta la respuesta farmacológica en la próstata y para modelar la resistencia a los medicamentos.
Estos métodos se pueden aplicar a los sistemas de cultivo organoides que utilizan el método de chapado de cúpula. Sin embargo, los componentes de los medios, como los factores de crecimiento, pueden diferir dependiendo del tipo de tejido. La demostración visual permitirá una discusión más específica y detallada de los pasos del protocolo y cómo difieren de los muchos otros sistemas de cultivo organoide publicados disponibles para los investigadores.
El cultivo organoide suele llevar más tiempo que el cultivo celular bidimensional. Asegúrese de asignar tiempo adicional para estos métodos. Comienza por aislar los organoides prostáticos del ratón o del tejido humano.
Mince y digerir enzimáticamente el tejido para producir una sola suspensión celular, luego recoger las células por centrifugación a 300 veces g durante cinco minutos. Contar las células y resuspenderlas en la matriz de membrana del sótano. A continuación, platéquelos a la densidad adecuada en las cúpulas de matriz en placas de cultivo organoides precalentó.
Las cúpulas deben estar a dos milímetros de distancia entre sí y desde el lado del pozo. Una vez solidificado, agregue suavemente medios desde el lado del pozo para evitar interrumpir la matriz. Después de que las cúpulas se hayan solidificado, agregue medios en la parte superior de la cúpula para que estén completamente cubiertos.
Aumente los organoides a la cantidad deseada para aplicaciones posteriores que determinan el número de células con métodos de conteo estándar. Cuando los organoides estén listos para usar, elabore el medio con una pipeta Pten00 y pipetee hacia arriba y hacia abajo para interrumpir la matriz de membrana del sótano. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros y centrífuga a 300 veces g durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante y lavar el pellet celular con cinco mililitros de PBS. Repita la centrifugación, luego resuspender el pellet en cuatro mililitros de reemplazo de trippsina y dejar que digerir durante cinco a 10 minutos mientras agita a 37 grados centígrados. Añadir un volumen igual de medio organoide con 10%FBS para inhibir el reemplazo de trippsina y centrifugar el tubo a 300 veces g durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en un mililitro de PBS. A continuación, tensar las células con un filtro de 40 micrómetros para asegurar la suspensión de una sola célula y contarlas usando un hemocicómetro. Diluir la suspensión celular a 100 células por cada 10 microlitros utilizando un medio organoide con 10 inhibidores micromolares de la rho quinasa Y27632.
Transfiera 1.100 células a un nuevo tubo cónico y agregue 285 microlitros de matriz de membrana de sótano que resultará en una concentración de matriz del 70%. A continuación, sembrar las células en 35 microlitros de cúpulas de matriz en una placa precalentada de 24 pozos asegurándose de planchar de tres a cinco réplicas por muestra. Voltee la placa y colóquela en una incubadora celular para solidificar la matriz del sótano.
Después de 10 minutos, retire la placa de la incubadora y agregue el medio que contenga el inhibidor de la quinasa. Actualizar el medio cada dos días y después de siete días, contar el número de organoides establecidos por cúpula y calcular el porcentaje de organoides formados a partir del número total de células. Después de aislar los organoides como se describió anteriormente, la semilla 1.000 a 10.000 células en la cúpula de la matriz utilizando la eficiencia de la formación organoides y la velocidad de crecimiento como un proxy para determinar el número de célula final.
A continuación, sembrar 35 microlitros de cúpulas de matriz en una placa de 24 pozos y dejar que la cúpula se solidifique. Añadir medio que contenga el inhibidor de la rho quinasa y el fármaco de elección. Realizar un registro 10 incremental para determinar la mitad de la concentración inhibitorable máxima utilizando el vehículo en el que el fármaco se disolvió como un control.
Refrescar el medio cada dos o tres días y analizar los organoides en el día siete para determinar la respuesta farmacológica al medicamento mediante la realización de un ensayo de viabilidad celular como se describe en el manuscrito. Para planchar fragmentos organoides sin tripsinización, utilice una pipeta Pten00 para aspirar el medio y pipetear hacia arriba y hacia abajo para interrumpir la matriz de membrana del sótano. Cuando la matriz esté completamente interrumpida, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros y centrífuga a 300 veces g durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante y añadir cinco mililitros de PBS. Después del lavado, resuspender los organoides en un mililitro de PBS y interrumpir los organoides por trituración con una pipeta de vidrio Pasteur. Cuantifique el número de fragmentos organoides y siembra cinco réplicas con 100 fragmentos como se describió anteriormente.
Siete días después, realice un ensayo de viabilidad celular de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Las células basales de próstata de tipo salvaje demostraron una formación organoide superior en comparación con las células luminales. Se logró un aumento menor en la formación de organoides con la pérdida mediada por CRISPR-Cas9 de Pten o P53 y la pérdida de la capacidad de formación adicional de ambos.
Los efectos de las moléculas anti-androgénicas en el crecimiento fueron probados en organoides murino con diferentes genotipos. Pérdida de P53 no causó resistencia a las moléculas anti-androgénicas, pero la pérdida de Pten mayor resistencia. La pérdida doble de P53 y Pten, sin embargo, resultó en una resistencia completa.
Inhibición del receptor de andrógenos también alteró los fenotipos. Los organoides de tipo salvaje eliminados por Pten y P53 demostraron la disminución en el tamaño de los lúmenes organoides, mientras que los organoides con pérdida de Pten y P53 no se vieron afectados. Como era de esperar, cuando estas células fueron injertadas por vía subcutánea en el flanco, sólo crecieron los organoides Pten y P53 eliminados dos veces.
Dos distintos organoides de cáncer de próstata humano MSKPCA2 y MSKPCA3 fueron probados para su respuesta a moléculas anti-androgénicas. La proliferación de organoides MSKPCA2 se inhibió fuertemente, mientras que los organoides MSKPCA3 no se veron afectados. MSKPCA2 expresó altos niveles de receptores de andrógenos y FKBP5, así como proteínas luminales distintivas.
MSKPCA3 también expresó marcadores basales y mesenquimales y no mostró ninguna expresión de FKBP5 que sugiriera que estos organoides modelan un fenotipo no luminal independiente de andrógenos. Los organoides deben interrumpirse periódicamente ya sea por la tripsinación o la trituración con una pipeta de vidrio para seguir siendo viables. La frecuencia depende del origen y el genotipo de las especies.
Cualquier tipo de experimento de secuenciación o proteómica de próxima generación se puede realizar siguiendo los procedimientos descritos. Estos experimentos investigarían la base molecular de los fenotipos y las respuestas farmacológicas. Esta técnica de cultivo organoide tridimensional permite a los investigadores estudiar las respuestas farmacológicas en un contexto genético altamente controlado in vitro.
Esto puede ser una alternativa confiable a los estudios in vivo largos.
