Dieses Protokoll bietet Standard- und reproduzierbare Methoden zur Beurteilung pharmakologischer Reaktionen in Prostataorganoidkulturen. Prostataorganoidkulturen bieten ein In-vitro-System, das viele Aspekte der In-vivo-Biologie und pharmakologischen Reaktion bewahrt, indem es Zellen ermöglicht, eine dreidimensionale Struktur in einer Kellermembranmatrix anzunehmen. Wir freuen uns besonders über die Verwendung dieser Methoden, um zu beurteilen, wie der Genotyp die pharmakologische Reaktion in der Prostata diktiert und die Arzneimittelresistenz zu modellieren.
Diese Methoden können auf organoide Kultursysteme angewendet werden, die die Dome-Beschichtungsmethode verwenden. Die Komponenten in den Medien, wie z. B. Wachstumsfaktoren, können jedoch je nach Gewebetyp unterschiedlich sein. Die visuelle Demonstration wird eine genauere und detailliertere Diskussion der Protokollschritte und ihrer Unterschiede zu den vielen anderen veröffentlichten organoiden Kultursystemen ermöglichen, die Forschern zur Verfügung stehen.
Organoidkultur ist in der Regel zeitaufwändiger als zweidimensionale Zellkultur. Achten Sie darauf, zusätzliche Zeit für diese Methoden zuzuweisen. Beginnen Sie mit der Isolierung von Prostataorganoiden aus Maus oder menschlichem Gewebe.
Hacken und enzymatisch verdauen das Gewebe, um eine einzellige Suspension zu produzieren, dann sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 mal g für fünf Minuten. Zählen Sie die Zellen und setzen Sie sie in der Kellermembranmatrix wieder aus. Dann platten sie mit der entsprechenden Dichte in den Matrixkuppeln auf vorgewärmten organoiden Kulturplatten.
Kuppeln sollten zwei Millimeter voneinander entfernt und von der Seite des Brunnens sein. Nach der Erstarrung, fügen Sie vorsichtig Medien von der Seite des Brunnens, um zu vermeiden, dass die Matrix gestört. Nachdem die Kuppeln verfestigt haben, fügen Sie Medien auf der Oberseite der Kuppel, so dass sie vollständig bedeckt sind.
Wachsen Sie Organoide auf die gewünschte Menge für nachgeschaltete Anwendungen, die die Zellzahl mit Standardzählmethoden bestimmen. Wenn die Organoide einsatzbereit sind, ziehen Sie das Medium mit einer Pten00 Pipette und Pipette nach oben und unten, um die Kellermembranmatrix zu stören. Die Suspension fünf Minuten lang auf ein 15 Milliliter Konisches Rohr und eine Zentrifuge mit 300 mal g übertragen.
Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet mit fünf MilliliterPBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation, setzen Sie das Pellet dann in vier Milliliter Trypsin-Ersatz wieder auf und lassen Sie es fünf bis zehn Minuten verdauen, während es bei 37 Grad Celsius schüttelt. Fügen Sie ein gleiches Volumen organoiden Mediums mit 10%FBS hinzu, um den Trypsin-Ersatz zu hemmen und das Rohr fünf Minuten lang bei 300 mal g zentrifugieren.
Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter PBS wieder aus. Dann die Zellen mit einem 40-Mikrometer-Filter belasten, um eine einzellige Suspension zu gewährleisten und sie mit einem Hämozytometer zu zählen. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 100 Zellen pro 10 Mikroliter mit Organoidmedium mit 10 Mikromolar-Rho-Kinase-Inhibitor Y27632.
Übertragen Sie 1, 100 Zellen in ein neues konisches Rohr und fügen Sie 285 Mikroliter Kellermembranmatrix hinzu, was zu einer Matrixkonzentration von 70 % führt. Als nächstes säen Sie die Zellen in 35 Mikroliter Matrixkuppeln in einer vorgewärmten 24 WellPlatte, die dafür sorgt, dass pro Probe drei bis fünf Wiederholungen vergoldet werden. Drehen Sie die Platte und legen Sie sie in einen Zellinkubator, um die Kellermatrix zu verfestigen.
Nach 10 Minuten die Platte aus dem Inkubator entfernen und Medium hinzufügen, das den Rhokinase-Inhibitor enthält. Erfrischen Sie das Medium alle zwei Tage und nach sieben Tagen, zählen Sie die Anzahl der Pro-Kopf-Gebildeten und berechnen Sie den Prozentsatz der Organoide, die aus der Gesamtzahl der Zellen gebildet werden. Nach der Isolierung der Organoide wie zuvor beschrieben, Samen 1 000 bis 10 000 Zellen in der Matrixkuppel mit Organoid-Bildung Effizienz und Wachstumsgeschwindigkeit als Proxy für die Bestimmung der endgültigen Zellzahl.
Dann säen Sie 35 Mikroliter Matrixkuppeln in einer 24-Well-Platte und lassen Sie die Kuppel verfestigen. Fügen Sie Medium mit dem Rho-Kinase-Inhibitor und dem Medikament der Wahl hinzu. Führen Sie ein Log 10 inkrementell durch, um die halbmaximale hemmende Konzentration mit dem Fahrzeug zu bestimmen, in dem das Medikament als Kontrolle gelöst wurde.
Erfrischen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage und analysieren Sie die Organoide am siebten Tag, um die pharmakologische Reaktion auf das Medikament zu bestimmen, indem Sie einen Zelllebensfähigkeitstest durchführen, wie im Manuskript beschrieben. Um organoide Fragmente ohne Trypsinisierung zu verplatten, verwenden Sie eine Pten00 Pipette, um das Medium und die Pipette nach oben und unten zu saugen, um die Kellermembranmatrix zu stören. Wenn die Matrix vollständig gestört ist, übertragen Sie die Suspension fünf Minuten lang auf ein 15 Milliliter konisches Rohr und eine Zentrifuge bei 300 mal g.
Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu. Nach dem Waschen die Organoide in einem Milliliter PBS wieder aussetzen und die Organoide durch Triturierung mit einer gläsernen Pasteurpipette stören. Quantifizieren Sie die Anzahl der organoiden Fragmente und Samen fünf Repliken mit 100 Fragmenten, wie zuvor beschrieben.
Sieben Tage später führen Sie einen Zelllebensfähigkeitstest nach Manuskriptanweisungen durch. Wilde Prostatabasalzellen zeigten eine überlegene Organoidbildung im Vergleich zu Leuchtzellen. Eine geringfügige Erhöhung der Organoidbildung wurde mit CRISPR-Cas9-vermitteltem Verlust von Pten oder P53 und Verlust der beiden weiteren erhöhten Formationskapazität erreicht.
Die Auswirkungen von anti-androgenen Molekülen auf das Wachstum wurden in murinen Organoiden mit verschiedenen Genotypen getestet. Verlust von P53 verursachte keine Resistenz gegen die anti-androgenen Moleküle, aber Verlust von Pten erhöhte Resistenz. Der doppelte Verlust von P53 und Pten führte jedoch zu einem vollständigen Widerstand.
Androgen-Rezeptor-Hemmung veränderte auch Phänotypen. Wild-Typ Pten gelöscht und P53 gelöschtE Organoide zeigten die Abnahme der organoiden Lumengröße, während Organoide mit Verlust von Pten und P53 waren phänotypisch unbeeinflusst. Wie erwartet, als diese Zellen subkutan in der Flanke transplantiert wurden, wuchsen nur die doppelt gelöschten Pten- und P53-Organoide.
Zwei verschiedene menschliche Prostatakrebs-Organoide MSKPCA2 und MSKPCA3 wurden auf ihre Reaktion auf antiandrogene Moleküle getestet. Die Proliferation von MSKPCA2-Organoiden wurde stark gehemmt, während MSKPCA3-Organoide nicht betroffen blieben. MSKPCA2 drückte hohe Konzentrationen von Androgenrezeptoren und FKBP5 sowie markante leuchtdichte Proteine.
MSKPCA3 drückte auch basale und mesenchymale Marker aus und zeigte keinen Ausdruck von FKBP5, was darauf hindeutet, dass diese Organoide einen nicht-luminalen Androgen-unabhängigen Phänotyp modellieren. Organoide müssen in regelmäßigen Abständen entweder durch Trypsinisierung oder Triturierung mit einer Glaspipette gestört werden, um lebensfähig zu bleiben. Die Häufigkeit hängt vom Ursprung der Art und dem Genotyp ab.
Nach den beschriebenen Verfahren kann jede Art von Sequenzierungs- oder Proteomikexperiment der nächsten Generation durchgeführt werden. Diese Experimente würden die molekulare Grundlage der Phänotypen und pharmakologischen Reaktionen untersuchen. Diese dreidimensionale organoide Kulturtechnik ermöglicht es Forschern, pharmakologische Reaktionen in einem hochgradig kontrollierten genetischen Kontext in vitro zu untersuchen.
Dies kann eine zuverlässige Alternative zu langwierigen In-vivo-Studien sein.
