Cette méthode permet une capturisation impartiale de l’expression des gènes des microglies à un niveau unicellique, ce qui peut aider à élucider l’hétérogénéité moléculaire des microglies dans un cerveau sain et diseaseé. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une procédure détaillée pour l’isolement rapide des microglies de différentes régions du cerveau et montre comment générer efficacement la base de jeu des bibliothèques RA6 à cellule unique pour le séquençage profond. Pour commencer cette procédure, préparez tous les tampons et solutions nécessaires tels qu’ils sont décrits dans le protocole textuel et refroidissez-les sur la glace.
Après avoir euthanasié et décapité la souris, utilisez de petits ciseaux pour ouvrir la peau sur la tête pour exposer le crâne en dessous. Ensuite, coupez à travers la suture sagittale, la suture lambdoidal, et la suture coronale. Utilisez des forceps pour retirer les deux côtés de l’os pariétal et de l’os interpariétal sans endommager le tissu et déplacer soigneusement le cerveau dans une dissection boîte de Petri contenant moyen A.À l’aide d’une lame pré-réfrigérée, couper le cerveau à travers la ligne médiane en deux hémisphères.
Utilisez le nombre 55 forceps pour séparer le cervelet du lobe cortical et du tronc cérébral. Ensuite, utilisez le nombre 55 forceps pour disséquer soigneusement l’hippocampe et le striatum du cortex et transférer chaque tissu dans une boîte de Pétri de collection séparée. Tout d’abord, utilisez une lame de rasoir pour couper chaque région du cerveau en morceaux fins de moins d’un millimètre cube.
À l’aide d’une pipette d’un millilitre avec la pointe coupée, transférer les morceaux de tissu dans des homogénéisateurs Dounce pré-refroidis. Homogénéiser le tissu en tordant lentement le piston dans et hors de l’homogénéiseur Dounce pendant six à 10 coups complets jusqu’à ce qu’aucun morceau visible ne soit présent. Ensuite, transférez les tissus dissociés dans des tubes de 50 millilitres à travers 70 passoires micrométriques.
Rincer chaque homogénéiseur et piston Dounce avec un total de six millilitres de milieu froid A puis transférer le rinçage dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation. Centrifugeuse suspension à cellules simples à 400 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes avec une pause à cinq. Rincez une grande colonne d’épuisement et trois grandes colonnes de sélection dans un séparateur magnétique avec trois millilitres de MCS.
Lorsque la centrifugation pour les échantillons de tissus est terminée, pipette et jeter supernatant sans déranger la pastille. Resuspendez les cellules dans le tampon MCS qui contient l’inhibiteur de la RNase. Ajouter 100 microlitres de perles d’élimination de la myéline à chaque tube contenant des cellules re-suspendues du cortex et du cervelet et ajouter 50 microlitres de perles d’élimination de la myéline à chacun des tubes contenant des cellules re-suspendues de l’hippocampe et du striatum.
Incuber les tubes sur la glace pendant 10 minutes. Après cela, ajouter mcs au tube contenant des cellules corticales pour porter son volume jusqu’à deux millilitres et aux tubes restants pour amener chacun de leurs volumes jusqu’à un millilitre. Une fois que les colonnes sont vides de tampon de rinçage, chargez deux millilitres de cellules corticales sur la grande colonne d’épuisement et un millilitre de suspension cellulaire sur de grandes colonnes de sélection séparées.
Ensuite, lavez les grandes colonnes d’épuisement avec un millilitre de tampon MCS et lavez chaque grande colonne de sélection deux fois à l’aide d’un millilitre de tampon MCS pour chaque lavage. Filtrer les cellules à travers 35 bouchons de passoire à microlitres dans des tubes FACS à fond rond. Centrifuger ces tubes à 400 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour pelleter les cellules.
Puis, versez lentement le surnatant et tamponnez le bord du tube sur du papier de soie. Resuspendez les cellules dans chaque tube avec 300 microlitres de tampon FACS. Tout d’abord, ajoutez cinq microlitres de récepteurs FC de souris bloquent le reagent à chaque tube.
Incuber sur la glace pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez un microlitre de CD45 PE taille sept et un microlitre de CD11B BV421 à chaque tube. Incuber les tubes sur un shaker à température ambiante pendant 10 minutes.
Après cela, ajouter deux millilitres de tampon FACS pour laver. Centrifugeuse à 400 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour pelleter les cellules. Resuspendez les cellules dans chaque tube avec 400 microlitres de tampon FACS contenant un microlitre d’inhibiteur de la RNase et 0,5 microlitres d’iodure de propidium.
Suivant la procédure FACS standard, trier les microglies vivantes avec une buse de 100 micromètres en plaques PCR de 96 puits qui contiennent quatre microlitres de tampon de lyse dans chaque puits. Vortex brièvement les plaques et les faire tourner vers le bas à l’aide d’une centrifugeuse bench top. Conserver les assiettes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la préparation de la bibliothèque.
Lorsque vous êtes prêt à procéder, décongeler la plaque sur la glace. Utilisez un cycleur thermique pour effectuer une première transcription pour générer de l’ADNC et amplifier l’ADN avec une étape supplémentaire de digestion de l’exonucléase telle qu’elle est décrite dans le protocole de texte. Après cela, purifier l’ADNC en ajoutant 18 microlitres de perles magnétiques à chaque puits.
Incuber la plaque sur un support magnétique pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le supernatant et lavez les échantillons deux fois avec de l’éthanol fraîchement fait à 80 % à l’aide de 80 microlitres d’éthanol par puits pour chaque lavage. Pour effectuer le tagmentation, utilisez une machine à pipetage nanoliter pour mélanger 0,4 microlitres de chaque échantillon d’ADNC avec 1,2 microlitres de réachemins de tagmentation Tn5 de la trousse de préparation de la bibliothèque dans une plaque de 384 puits à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Pour arrêter la réaction de tagmentation, ajoutez 0,4 microlitres de tampon de neutralisation à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, à 384 index et 1,2 microlitres de PCR mélangés aux échantillons et amplifier les bibliothèques comme décrit dans le protocole de texte. Mettre en commun toutes les bibliothèques individuelles à partir de la même plaque de 384 puits ensemble et utiliser des perles magnétiques pour purifier les bibliothèques finales en commun.
Dans cette étude, les microglies sont isolées du cortex, du cervelet, de l’hippocampe et du striatum de l’hémisphère cérébral d’une souris adulte. La suspension cellulaire préparée est examinée au microscope à l’aide d’un trypan bleu et d’un hémocytomètre pour estimer le rendement, la viabilité cellulaire et l’efficacité de l’ablation de la myéline avant d’effectuer des taches d’anticorps. Le nombre total de cellules à ce stade devrait être supérieur à 30 000 pour le cortex et à plus de 5000 pour les autres tissus.
Plus de 90% des cellules devraient être viables avec peu de débris de myéline. Une machine FACS est utilisée pour trier les microglies, qui sont généralement CD45 faible et CD11B positif. L’isolement réussi devrait générer plus de 80% de microglies de toutes les cellules individuelles vivantes, au moins pour le tissu cortical.
Une fois que les microglies individuelles sont capturées dans le tampon de lyse, l’ARN est libéré et par la suite inversé transcrit à cDNA, qui est ensuite amplifié pendant 23 cycles. En tant que plate-forme d’électrophoresis capillaire, l’analyseur de fragments et les kits de fragments NGS hautement sensibles fournissent des informations rapides et précises sur la distribution de la taille, ainsi que la quantité de molécules d’ADNC présentes dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Des échantillons montrant un frottis entre 500 et 5000 paires de base et supérieurs à un certain seuil de concentration peuvent être utilisés pour faire des bibliothèques.
Les échantillons sont séquencés à une profondeur de plus d’un million de lues brutes par cellule, ce qui sature la puissance de détection de la méthodologie de séquençage de l’ARN à cellule unique. Avec un taux de cartographie d’environ 60% sur 2000 gènes peuvent être détectés par cellule microgliale. Les données précédemment publiées générées à partir de cette méthode d’isolement sont reproduites à partir d’expériences indépendantes, démontrant la sensibilité pour détecter des gènes spécifiques aux microglies à travers la population séquencée.
Avec l’information des transcriptions simples de microglies, les chercheurs peuvent découvrir les populations cellulaires uniques dans le contexte de leur intérêt, et étudier plus loin la pertinence fonctionnelle de ces populations nouvellement identifiées.
