Diese Methode ermöglicht eine unvoreingenommene Kapturisierung der Mikroglia-Genexpression auf einzelzelligem Niveau, was dazu beitragen kann, die molekulare Heterogenität von Mikroglia in einem gesunden und kranken Gehirn aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie ein detailliertes Verfahren für die schnelle Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen Gehirnregionen bietet und zeigt, wie man effizient Spielbasis der einzelligen RA6-Bibliotheken für die tiefe Sequenzierung generiert. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie alle erforderlichen Puffer und Lösungen, wie im Textprotokoll beschrieben, vor und kühlen Sie sie auf Eis.
Nach der Einschläferung und Enthauptung der Maus, verwenden Sie kleine Schere, um die Haut auf dem Kopf zu schneiden, um den Schädel darunter zu belichten. Dann durchschneiden Sie die sagittale Naht, Lambdoidal Naht, und koronare Naht. Verwenden Sie Zangen, um beide Seiten des parietalen Knochens und interparietalen Knochens abzuziehen, ohne das Gewebe zu beschädigen, und bewegen Sie das Gehirn vorsichtig in eine Sezier-Petrischale, die das Medium A enthält.
Verwenden Sie die Nummer 55 Zangen, um das Kleinhirn vom kortikalen Lappen und dem Hirnstamm zu trennen. Verwenden Sie dann die Nummer 55 Zangen, um den Hippocampus und das Striatum vorsichtig aus dem Kortex zu sezieren und jedes Gewebe in eine separate Sammlung Petrischale zu übertragen. Verwenden Sie zunächst eine Rasierklinge, um jede Hirnregion in feine Stücke zu hacken, die weniger als einen Kubikmillimeter betragen.
Mit einer Ein-Milliliter-Pipette mit abgeschnittener Spitze die Gewebeteile in vorgekühlte Dounce-Homogenisatoren übertragen. Homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie den Kolben langsam in und aus dem Dounce Homogenisator für sechs bis zehn volle Striche verdrehen, bis keine sichtbaren Brocken vorhanden sind. Dann übertragen Sie die dissoziierten Gewebe in 50 Milliliter-Röhren durch 70 Mikrometer Siebe.
Spülen Sie jeden Dounce Homogenisator und Kolben mit der Gesamtsumme von sechs Milliliter kaltem Medium A und übertragen Sie die Spülung dann auf ein 15 Milliliter Rohr für die Zentrifugation. Zentrifugen-Einzelzellsuspension bei 400 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten mit einer Pause bei fünf. Spülen Sie eine große Erschöpfungssäule und drei große Auswahlsäulen in einem magnetischen Separator mit drei MilliliterMCS.
Wenn die Zentrifugation für die Gewebeproben abgeschlossen ist, Pipette aus und entsorgen Überstand, ohne das Pellet zu stören. Setzen Sie die Zellen im MCS-Puffer, der RNase-Inhibitor enthält, wieder aus. Fügen Sie 100 Mikroliter Myelin-Entfernungsperlen zu jeder Röhre hinzu, die resuspendierte Zellen aus der Kortex und im Kleinhirn enthält, und fügen Sie 50 Mikroliter Myelinentfernungsperlen zu jedem der Röhren hinzu, die resuspendierte Zellen aus dem Hippocampus und Striatum enthalten.
Die Rohre 10 Minuten auf Eis bebrüten. Danach fügen Sie MCS in das Rohr mit kortikalen Zellen, um sein Volumen auf zwei Milliliter zu bringen und zu den verbleibenden Röhren, um jedes ihrer Volumen bis zu einem Milliliter zu bringen. Sobald die Spalten leer vom Spülpuffer sind, laden Sie zwei Milliliter kortikaler Zellen auf die große Erschöpfungssäule und einen Milliliter voneinander Zellsuspension auf separate große Auswahlspalten.
Als nächstes waschen Sie die großen Erschöpfungssäulen mit einem Milliliter MCS-Puffer und waschen Sie jede große Selektionssäule zweimal mit einem Milliliter MCS-Puffer für jede Wäsche. Filtern Sie die Zellen durch 35 Mikroliter Siebkappen in rund-bodenige FACS-Röhren. Zentrifugieren Sie diese Rohre bei 400 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen zu pellet.
Dann gießen Sie langsam den Überstand aus und tupfen sie den Rand des Rohres auf Tissuepapier aus. Setzen Sie die Zellen in jedem Rohr mit 300 Mikroliter FACS-Puffer wieder aus. Fügen Sie zunächst fünf Mikroliter Maus FC-Rezeptoren Block Reagenz zu jeder Röhre.
Fünf Minuten auf Eis bebrüten. Dann fügen Sie einen Mikroliter CD45 PE Größe sieben und ein Mikroliter CD11B BV421 zu jeder Röhre hinzu. Inkubieren Sie die Rohre auf einem Shaker bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
Fügen Sie danach zwei Milliliter FACS-Puffer zum Waschen hinzu. Zentrifugieren Bei 400 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen zu pellet. Setzen Sie die Zellen in jedem Röhrchen mit 400 Mikroliter FACS-Puffer, der einen Mikroliter RNase-Inhibitor und 0,5 Mikroliter Propidiumjodid enthält, wieder ab.
Nach dem Standard-FACS-Verfahren sortieren Sie einzelne Lebende Mikroglia mit einer 100-Mikrometer-Düse in 96-Well-PCR-Platten, die jeweils vier Mikroliter Lysepuffer in jedem Brunnen enthalten. Wirbeln Sie die Platten kurz an und drehen Sie sie mit einer Tischzentrifuge nach unten. Bewahren Sie die Platten bei minus 80 Grad Celsius bis zur Bibliotheksvorbereitung auf.
Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, tauen Sie die Platte auf Eis auf. Verwenden Sie einen thermischen Cycler, um eine erste Transkription durchzuführen, um cDNA zu erzeugen und die cDNA mit einem zusätzlichen Exonuklease-Verdauungsschritt zu verstärken, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach reinigen Sie die cDNA, indem Sie jedem Brunnen 18 Mikroliter Magnetperlen hinzufügen.
Inkubieren Sie die Platte auf einem magnetischen Ständer für fünf Minuten. Dann entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Proben zweimal mit frisch hergestelltem 80%Ethanol mit 80 Mikroliter Ethanol pro Brunnen für jede Wäsche. Um die Tagmentierung durchzuführen, verwenden Sie eine Nanoliter-Pipettiermaschine, um 0,4 Mikroliter jeder cDNA-Probe mit 1,2 Mikroliterteinen Tn5-Tagmentationsreagenzien aus dem Bibliotheksvorbereitungskit in einer 384-Well-Platte bei 55 Grad Celsius für 10 Minuten zu mischen.
Um die Tagmentationsreaktion zu stoppen, fügen Sie 0,4 Mikroliter Neutralisationspuffer bei Raumtemperatur für fünf Minuten hinzu. Als nächstes werden bei 384 Indizes und 1,2 Mikroliter PCR zu den Samples gemischt und die Bibliotheken wie im Textprotokoll beschrieben verstärkt. Bündeln Sie alle einzelnen Bibliotheken aus der gleichen 384-Well-Platte zusammen und verwenden Sie magnetische Perlen, um die letzten gepoolten Bibliotheken zu reinigen.
In dieser Studie werden Mikroglia aus dem Kortex, Kleinhirn, Hippocampus und Striatum der Gehirnhälfte einer erwachsenen Maus isoliert. Die vorbereitete Zellsuspension wird unter dem Mikroskop mit Trypanblau und einem Hämozytometer untersucht, um die Ausbeute, Zelllebensfähigkeit und Wirksamkeit der Myelinentfernung vor der Durchführung von Antikörperfärbungen zu schätzen. Die Gesamtzahl der Zellwerte sollte zu diesem Zeitpunkt über 30.000 für den Kortex und über 5 000 für die anderen Gewebe betragen.
Über 90% der Zellen sollten mit wenig Myelin-Trümmern lebensfähig sein. Eine FACS-Maschine wird verwendet, um die Mikroglia zu sortieren, die in der Regel CD45 niedrig und CD11B positiv sind. Eine erfolgreiche Isolierung sollte über 80% Mikroglia aus allen lebenden Einzelzellen erzeugen, zumindest für das kortikale Gewebe.
Sobald einzelne Mikroglia in den Lysepuffer eingefangen werden, wird RNA freigesetzt und anschließend in cDNA umgeschrieben, die dann für 23 Zyklen verstärkt wird. Als Kapillarelektrophorese-Plattform liefern der Fragmentanalysator und die hochempfindlichen NGS-Fragmentkits schnelle und genaue Informationen über die Größenverteilung sowie die Menge der cDNA-Moleküle, die in jedem Brunnen einer 96-Well-Platte vorhanden sind. Proben, die einen Abstrich zwischen 500 und 5 000 Basenpaaren zeigen und einen bestimmten Konzentrationsschwellenwert überschreiten, können verwendet werden, um Bibliotheken herzustellen.
Die Proben werden bis zu einer Tiefe von über einer Million Rohlesevorgängen pro Zelle sequenziert, was die Detektionsleistung der einzelligen RNA-Sequenzierungsmethode sätttigt. Mit einer Kartierungsrate von ca. 60% über 2.000 Genen kann pro Mikrogliazelle nachgewiesen werden. Zuvor veröffentlichte Daten, die aus dieser Isolationsmethode generiert wurden, werden aus unabhängigen Experimenten reproduziert, was die Empfindlichkeit für den Nachweis mikrogliaspezifischer Gene in der sequenzierten Population demonstriert.
Mit den Informationen einzelner Mikroglia-Transkriptionen können Forscher die einzigartigen Zellpopulationen im Kontext ihres Interesses entdecken und die funktionelle Relevanz dieser neu identifizierten Populationen weiter untersuchen.
