Este método permite la captura imparcial de la expresión génica de microglia a un nivel de una sola célula, lo que puede ayudar a dilucidar la heterogeneidad molecular de la microglia en un cerebro sano y enfermo. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un procedimiento detallado para el aislamiento rápido de la microglia de diferentes regiones cerebrales y muestra cómo generar eficientemente la base de juego de las bibliotecas RA6 de una sola célula para la secuenciación profunda. Para comenzar este procedimiento, prepare todos los búferes y soluciones necesarios como se describe en el protocolo de texto y enfríelos en hielo.
Después de eutanasiar y decapitar al ratón, usa tijeras pequeñas para abrir la piel de la cabeza para exponer el cráneo debajo. Luego, corte a través de la sutura sagital, sutura lambdoidal y sutura coronal. Use fórceps para extraer ambos lados del hueso parietal y el hueso interparietal sin dañar el tejido y mueva cuidadosamente el cerebro a una disección de petri plato que contenga el medio A.Usando una cuchilla pre-enfriada, corte el cerebro a través de la línea media en dos hemisferios.
Utilice fórceps número 55 para separar el cerebelo del lóbulo cortical y el tallo cerebral. Luego, usa fórceps número 55 para diseccionar cuidadosamente el hipocampo y el estriado de la corteza y transferir cada tejido a una colección separada de Petri. En primer lugar, usa una cuchilla de afeitar para cortar cada región del cerebro en trozos finos que sean menos de un milímetro cúbico.
Usando una pipeta de un mililitro con la punta cortada, transfiera las piezas de tejido en homogeneizadores Dounce pre-enfriados. Homogeneizar el tejido girando lentamente el pistón dentro y fuera del homogeneizador Dounce durante seis a 10 trazos completos hasta que no haya trozos visibles. Luego, transfiera los tejidos disociados a tubos de 50 mililitros a través de coladores de 70 micrómetros.
Enjuague cada homogeneizador y pistón Dounce con el total de seis mililitros de medio frío A y luego transfiera el enjuague a un tubo de 15 mililitros para centrifugación. Centrifugar la suspensión de una sola célula a 400 g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos con un descanso a las cinco. Enjuague una columna de agotamiento grande y tres columnas de selección grandes en un separador magnético con tres mililitros de MCS.
Cuando la centrifugación de las muestras de tejido esté completa, pipetee y deseche el sobrenadante sin alterar el pellet. Resuspender las células en el búfer MCS que contiene inhibidor de la Ródana. Añadir 100 microlitros de perlas de extracción de mielina a cada tubo que contenga células re-suspendidas de la corteza y el cerebelo y añadir 50 microlitros de perlas de eliminación de mielina a cada uno de los tubos que contienen células re-suspendidas del hipocampo y el estriado.
Incubar los tubos sobre hielo durante 10 minutos. Después de esto, agregue MCS al tubo que contiene células corticales para llevar su volumen hasta dos mililitros y a los tubos restantes para llevar cada uno de sus volúmenes hasta un mililitro. Una vez que las columnas estén vacías de búfer de enjuague, cargue dos mililitros de celdas corticales en la columna de agotamiento grande y un mililitro de la suspensión de celdas entre sí en columnas de selección grandes separadas.
A continuación, lave las columnas de agotamiento grandes con un mililitro de tampón MCS y lave cada columna de selección grande dos veces con un mililitro de tampón MCS para cada lavado. Filtre las células a través de 35 tapas de colador de microlitros en tubos FACS de fondo redondo. Centrifugar estos tubos a 400 veces g y a cuatro grados Celsius durante cinco minutos para peletizar las células.
Luego, vierta lentamente el sobrenadante y deslice el borde del tubo sobre papel tisú. Resuspender las células en cada tubo con 300 microlitros de tampón FACS. En primer lugar, agregue cinco microlitros de reactivos de bloque de receptores FC de ratón a cada tubo.
Incubar sobre hielo durante cinco minutos. A continuación, agregue un microlitrotro de CD45 PE tamaño siete y un microlitrotro de CD11B BV421 a cada tubo. Incubar los tubos de una coctelera a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de esto, agregue dos mililitros de tampón FACS para lavar. Centrifugar a 400 veces g y a cuatro grados Celsius durante cinco minutos para peletizar las células. Resuspender las células en cada tubo con 400 microlitros de tampón FACS que contienen un microlitro de inhibidor de la RSEa y 0,5 microlitros de yoduro de propidium.
Siguiendo el procedimiento estándar de FACS, clasifúle una sola microglia viva con una boquilla de 100 micrómetros en placas PCR de 96 pozos que contienen cuatro microlitros de tampón de lelisis en cada pozo. Vóter brevemente las placas y girarlas hacia abajo usando una centrífuga de sobremesa. Guarde las placas a menos 80 grados centígrados hasta la preparación de la biblioteca.
Cuando esté listo para proceder, descongele la placa sobre hielo. Utilice un ciclor térmico para realizar una primera transcripción para generar ADNc y amplificar el ADNc con un paso adicional de digestión de exonucleasa como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, purifica el ADNC añadiendo 18 microlitros de cuentas magnéticas a cada pozo.
Incubar la placa en un soporte magnético durante cinco minutos. A continuación, retire el sobrenadante y lave las muestras dos veces con 80% de etanol recién hecho usando 80 microlitros de etanol por pozo para cada lavado. Para realizar la etiquetado, utilice una pipeteadora de nanolitros para mezclar 0,4 microlitros de cada muestra de ADNn a 1,2 microlitros de reactivos de etiquetado Tn5 del kit de preparación de la biblioteca en una placa de 384 pozos a 55 grados Centígrados durante 10 minutos.
Para detener la reacción de etiquetado, añada 0,4 microlitros de tampón de neutralización a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, en 384 índices y 1,2 microlitros de PCR mezclados con las muestras y amplificar las bibliotecas como se describe en el protocolo de texto. Agrupa todas las bibliotecas individuales de la misma placa de 384 pozos y usa cuentas magnéticas para purificar las bibliotecas agrupadas finales.
En este estudio, la microglia se aísla de la corteza, el cerebelo, el hipocampo y el estriado del hemisferio cerebral de un ratón adulto. La suspensión celular preparada se examina bajo un microscopio mediante el uso de tripano azul y un hemocicómetro para estimar el rendimiento, la viabilidad celular y la eficacia de la eliminación de mielina antes de realizar la tinción de anticuerpos. El recuento total de células en este punto debe ser superior a 30.000 para la corteza y a más de 5.000 para los otros tejidos.
Más del 90% de las células deben ser viables con pequeños desechos de mielina. Una máquina FACS se utiliza para ordenar la microglia, que son típicamente CD45 baja y CD11B positiva. El aislamiento exitoso debe generar más del 80%microglia de todas las células individuales vivas, al menos para el tejido cortical.
Una vez que la microglia individual se captura en el búfer de lisis, el ARN se libera y posteriormente se transcribe inversamente a cDNA, que luego se amplifica durante 23 ciclos. Como plataforma de electroforesis capilar, el analizador de fragmentos y los kits de fragmentos NGS de alta sensibilidad proporcionan información rápida y precisa sobre la distribución del tamaño, así como la cantidad de moléculas de ADNd están presentes en cada pozo de una placa de 96 pozos. Las muestras que muestran un frotis entre 500 y 5.000 pares base y están por encima de un cierto umbral de concentración se pueden utilizar para hacer bibliotecas.
Las muestras se secuencian a una profundidad de más de un millón de lecturas en bruto por célula, lo que satura el poder de detección de la metodología de secuenciación de ARN de una sola célula. Con una tasa de mapeo de aproximadamente 60% sobre 2.000 genes se pueden detectar por célula microglial. Los datos publicados anteriormente generados a partir de este método de aislamiento se reproducen a partir de experimentos independientes, lo que demuestra la sensibilidad para detectar genes específicos de microglia en toda la población secuenciada.
Con la información de las transcripciones de microglia única, los investigadores pueden descubrir las poblaciones celulares únicas en el contexto de su interés, y estudiar más a fondo la relevancia funcional de estas poblaciones recién identificadas.
