Этот метод позволяет объективно каптуризации экспрессии генов микроглии на одноклеточном уровне, что может помочь выяснить молекулярную неоднородность микроглии в здоровом и больном мозге. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает детальную процедуру быстрой изоляции микроглии от различных областей мозга и показывает, как эффективно генерировать игровой базой одноклеточные библиотеки RA6 для глубокого секвенирования. Для начала этой процедуры подготовьте все необходимые буферы и решения, изложенные в текстовом протоколе, и охладите их на льду.
После усыпания и обезглавливания мыши, используйте небольшие ножницы, чтобы разрезать кожу на голове, чтобы разоблачить череп под ним. Затем прорезать сагиттаальный шов, овсяный шов и корональный шов. Используйте типсы, чтобы снять обе стороны теменной кости и межпариетальной кости, не повреждая ткани и осторожно переместить мозг в вскрытие чашки Петри, содержащей средний A.Using предварительно охлажденного лезвия, сократить мозг через середину на два полушария.
Используйте 55 типсов, чтобы отделить мозжечок от корковой доли и ствола мозга. Затем используйте 55 типсов, чтобы тщательно вскрыть гиппокамп и стриатум из коры и перенести каждую ткань в отдельную коллекцию чашки Петри. Во-первых, используйте лезвие бритвы, чтобы нарезать каждую область мозга на мелкие кусочки, которые меньше, чем один кубический миллиметр.
Используя одноми миллилитровую пипетку с отрезанным кончиком, перенесите кусочки ткани в предварительно охлажденные гомогенизаторы Dounce. Гомогенизировать ткани, медленно скручивания поршня в и из Dounce гомогенизатора в течение шести до 10 полных ударов, пока не видимые куски присутствуют. Затем перенесите диссоциированные ткани в 50 миллилитровых трубок через 70 микрометровых ситечкой.
Промыть каждый Dounce гомогенизатор и поршень в общей сложности шесть миллилитров холодной среды, а затем передать полоскания в 15 миллилитров трубки для центрифугации. Центрифуга одноклеточной подвески при 400 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут с перерывом в пять. Промыть один большой столбец истощения и три больших столбца выбора в магнитном сепараторе с тремя миллилитров MCS.
Когда центрифугация образцов тканей завершена, пипетка и отказаться от супернатанта, не нарушая гранулы. Повторное использование клеток в буфере MCS, который содержит ингибитор RNase. Добавьте 100 микролитров шариков удаления миелина в каждую трубку, содержащую повторно приостановленные клетки из коры и мозжечка, и добавьте 50 микролитров бусинок удаления миелина в каждую из трубок, содержащих повторно приостановленные клетки из гиппокампа и стриатума.
Инкубировать трубки на льду в течение 10 минут. После этого добавьте MCS в трубку, содержащую корковые клетки, чтобы довести его объем до двух миллилитров и до остальных трубок, чтобы довести каждый из их объемов до одного миллилитра. После того, как столбцы пусты для полоскания буфера, загрузите два миллилитров корковых ячеек на большой столбец истощения и один миллилитр друг друга подвески ячейки на отдельные большие столбцы отбора.
Затем вымойте большие столбцы истощения одним миллилитром буфера MCS и помойте каждый большой столбец выделения дважды, используя один миллилитр буфера MCS для каждой стирки. Фильтр клетки через 35 микролитер ситечко шапки в круглое дно FACS труб. Центрифуга эти трубки в 400 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки.
Затем медленно вылейте супернатант и мазок края трубки на бумаге ткани. Перепродюсовать клетки в каждой трубке с 300 микролитров буфера FACS. Во-первых, добавьте пять микролитров рецепторов мыши FC блок реагент для каждой трубки.
Инкубировать на льду в течение пяти минут. Затем добавьте один микролитер cd45 PE размером семь и один микролитер CD11B BV421 к каждой трубке. Инкубировать трубки на шейкер при комнатной температуре в течение 10 минут.
После этого добавьте два миллилитров буфера FACS для мытья. Центрифуга при 400 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки. Повторное использование клеток в каждой трубке с 400 микролитров буфера FACS, содержащих один микролитер ингибитора RNase и 0,5 микролитров пропидия йодида.
Следуя стандартной процедуре FACS, сортируют одну живую микроглию со 100-метровым соплом в 96-колодец ПЦР пластин, которые содержат четыре микролитера буфера лиза в каждой колодец. Кратко вихрь пластин и спина их вниз с помощью скамейки верхней центрифуги. Храните тарелки при температуре минус 80 градусов по Цельсию до подготовки библиотеки.
Когда вы будете готовы к работе, разморозьйте плиту на льду. Используйте тепловой циклер для выполнения первой транскрипции для генерации кДНК и усиления кДНК с дополнительным шагом пищеварения экзонуклеазы, как указано в текстовом протоколе. После этого очистите cDNA, добавив 18 микролитров магнитных бусин к каждой хорошо.
Инкубировать пластину на магнитной подстоять в течение пяти минут. Затем снимите супернатант и мыть образцы дважды с свежеприготовленным 80%этанола с использованием 80 микролитров этанола на колодец для каждой стирки. Для выполнения тегментации используйте нанолитровую трубочную машину для смешивания 0,4 микролитров каждого образца cDNA с 1,2 микролитров реагентов Tn5 tagmentation из комплекта подготовки библиотеки в пластине 384-колодец при 55 градусах Цельсия в течение 10 минут.
Чтобы остановить реакцию тегментации, добавьте 0,4 микролитера буфера нейтрализации при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее, на 384 индексах и 1,2 микролитерах ПЦР смешиваются с образцами и усиливают библиотеки, как указано в текстовом протоколе. Объединить все отдельные библиотеки из той же пластины 384 хорошо вместе и использовать магнитные бусы для очистки окончательных объединенных библиотек.
В этом исследовании, микроглии изолированы от коры головного мозга, мозжечка, гиппокампа и стриатума полушария мозга взрослой мыши. Подготовленная клеточная подвеска изучается под микроскопом с помощью трипан-голубого и гемоцитометра для оценки урожайности, жизнеспособности клеток и эффективности удаления миелина перед выполнением окрашивания антител. Общее количество клеток на данный момент должно быть более 30 000 для коры и более 5000 для других тканей.
Более 90% клеток должны быть жизнеспособными с небольшим количеством мусора миелина. FacS машина используется для сортировки микроглии, которые, как правило, CD45 низким и CD11B положительным. Успешная изоляция должна генерировать более 80%микроглии из всех живых однок клеток, по крайней мере для корковых тканей.
После того, как отдельные микроглии захвачены в буфер лиза, РНК высвобождается, а затем обратно транскрибируется в cDNA, который затем усиливается в течение 23 циклов. Как капиллярная электрофорезная платформа, анализатор фрагментов и высокочувствительные наборы фрагментов NGS обеспечивают быструю и точную информацию о распределении размеров, а также количество молекул cDNA, присутствующих в каждом колодец 96-хорошо пластины. Образцы, показывающие мазок между 500 и 5000 базовых пар и выше определенного порога концентрации могут быть использованы для библиотек.
Образцы секвенированы на глубину более одного миллиона необработанных считывания на клетку, что насыщает способность обнаружения одноклеточной методологии секвенирования РНК. С картографической скоростью около 60%над 2, 000 генов могут быть обнаружены на микроглиальные клетки. Ранее опубликованные данные, полученные из этого метода изоляции, воспроизводятся в результате независимых экспериментов, демонстрируя чувствительность к обнаружению микроглии конкретных генов в последовательной популяции.
С информацией одиночных транскрипций микроглии, исследователя могут открыть уникально населенности клетки в смысле их интереса, и более далее изучить функциональную релевантность этих нов выявленных населенностей.
