Bu yöntem, mikroglia gen ekspresyonunun tek hücreli düzeyde tarafsız bir şekilde yakalanmasını sağlar, bu da sağlıklı ve hastalıklı bir beyinde mikroglianın moleküler heterojenliğini açıklığa kavuşturmada yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı beyin bölgelerinden mikroglia hızlı izolasyon için ayrıntılı bir prosedür sağlar ve nasıl verimli derin sıralama için tek hücreli RA6 kütüphaneleri oyun tabanı oluşturmak için gösterir. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli tüm arabellekleri ve çözümleri hazırlayın ve buz üzerinde soğutun.
Ötenazi ve fare nin kafasını kestikten sonra, altındaki kafatası ortaya çıkarmak için baş deri açık kesmek için küçük makas kullanın. Sonra, sagittal sütür, lambdoidal sütür ve koronal sütür ile kesti. Dokuya zarar vermeden parietal kemik ve interparietal kemiğin her iki tarafını koparmak için forseps kullanın ve beyni dikkatlice orta A içeren bir diseksiyonu petri kabına taşıyın.
Serebellum kortikal lob ve beyin sapı ayırmak için 55 numara forceps kullanın. Daha sonra, hipokampus ve korteksten striatum dikkatle incelemek ve ayrı bir koleksiyon Petri çanak içine her doku transferi için 55 numara forceps kullanın. İlk olarak, bir milimetreden daha az ince parçalar halinde her beyin bölgesi doğrayın için bir jilet kullanın.
Ucu kesilmiş bir mililitrelik pipet kullanarak, önceden soğutulmuş Dounce homogenizers içine doku parçaları aktarın. Görünür bir parça bulunana kadar altı ila 10 tam vuruş için piston'u Dounce homogenizer'ine yavaşça bükerek dokuyu homojenize edin. Daha sonra, 70 mikrometre süzgeçler aracılığıyla 50 mililitre tüpler içine ayrıştırılmış dokular aktarın.
Her dounce homogenizer ve piston soğuk orta A altı mililitre toplam durulayın sonra santrifüj için 15 mililitrelik bir tüp için durulama aktarın. Santrifüj tek hücreli süspansiyon 400 kez g ve dört derece santigrat beş dakika için beş bir mola ile. Bir büyük tükenme sütunu ve üç büyük seçim sütununu üç mililitre MCS ile manyetik ayırıcıda durulayın.
Doku örnekleri için santrifüj tamamlandığında, pipet dışarı ve pelet rahatsız etmeden supernatant atın. RNase inhibitörü içeren MCS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın. Korteks ve serebellum dan yeniden askıya alınan hücreleri içeren her tüp için miyelin kaldırma boncuk 100 mikrolitre ekleyin ve hipokampus ve striatum yeniden askıya hücreleri içeren tüplerin her birine miyelin kaldırma boncuk 50 mikrolitre ekleyin.
Tüpleri 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, iki mililitre kadar hacmini getirmek için kortikal hücreleri içeren tüp mcs ekleyin ve kalan tüplere bir mililitre kadar kendi hacimleri her getirmek için. Sütunlar durulama arabelleği boş aldıktan sonra, iki mililitre kortikal hücreyi büyük tükenme sütununa ve bir mililitresini ayrı büyük seçim sütunlarına yükleyin.
Ardından, büyük tükenme sütunundakileri bir mililitre MCS arabelleğiyle yıkayın ve her büyük seçim sütununu her yıkama için bir mililitre MCS tamponu kullanarak iki kez yıkayın. Hücreleri 35 mikrolitre süzgeç kapağından yuvarlak alt FACS tüplere süzün. Bu tüpleri 400 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca hücreyi peletlemek için santrifüj edin.
Sonra, yavaş yavaş supernatant dökün ve kağıt mendil üzerinde tüp kenarına dab. 300 mikrolitre FACS tamponu ile her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın. İlk olarak, her tüpe fare FC reseptörlerinin bloke reaktif beş mikrolitre ekleyin.
Beş dakika buzda kuluçkaya yat. Daha sonra, her tüpe bir mikrolitre CD45 PE boyutu yedi ve bir mikrolitre CD11B BV421 ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayıcıya yerleştirin.
Bundan sonra, yıkamak için FACS tampon iki mililitre ekleyin. 400 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca hücreleri pelet santrifüj. Bir mikrolitre RNase inhibitörü ve 0,5 mikrolitre propidium iyodür içeren 400 mikrolitre FACS tamponu ile her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın.
Standart FACS prosedürünü takiben, 100 mikrometre nozüllü tek canlı mikrogliayı, her kuyuda dört mikrolitre lysis tamponu içeren 96 kuyulu PCR plakalara sıralayın. Kısaca plakaları girdap ve bir tezgah üst santrifüj kullanarak aşağı spin. Plakaları kütüphane hazırlığına kadar eksi 80 derecede saklayın.
Devam etmeye hazır olduğunuzda, buz üzerinde plaka eritin. CDNA oluşturmak ve metin protokolünde belirtildiği gibi ek bir ekeksikleazazsa sindirim adımı ile cDNA yükseltmek için ilk transkripsiyon gerçekleştirmek için bir termal döngückullanın. Bundan sonra, her kuyuya 18 mikrolitre manyetik boncuk ekleyerek cDNA'yı arındırın.
Plakayı manyetik bir standda beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, supernatant çıkarın ve her yıkama için iyi başına etanol 80 mikrolitre kullanarak taze yapılmış% 80 etanol ile iki kez örnekleri yıkayın. Etiketleme gerçekleştirmek için, her cDNA numunesinin 0,4 mikrolitresini kütüphane hazırlama kitinden 1,2 mikrolitre Tn5 etiketleme reaktifiyle 10 dakika boyunca 55 derece lik bir plakaiçinde 384 kuyuluk bir plakayla karıştırmak için nanolitre lik bir pipetleme makinesi kullanın.
Etiketleme reaksiyonunu durdurmak için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0,4 mikrolitre nötralizasyon tamponu ekleyin. Daha sonra, 384 indeks ve 1.2 mikrolitre PCR örneklere karıştırılır ve metin protokolünde belirtildiği gibi kitaplıkları yükseltin. Aynı 384 kuyulu plakadan tüm kütüphaneleri bir araya getirin ve son havuzlu kütüphaneleri arındırmak için manyetik boncuklar kullanın.
Bu çalışmada, mikroglia korteks izole edilir, serebellum, hipokampus, ve yetişkin bir farebeyin hemisfer striatum. Hazırlanan hücre süspansiyonu antikor boyama yapmadan önce miyelin çıkarma verimi, hücre canlılığı ve etkinliğini tahmin etmek için trypan mavisi ve hemositometre kullanılarak mikroskop altında incelenir. Bu noktada toplam hücre sayısı korteks için 30,000 ve diğer dokular için 5.000'den fazla olmalıdır.
Hücrelerin %90'Dan fazlası az miyelin enkazıyla birlikte yaşayabilir. Bir FACS makine genellikle CD45 düşük ve CD11B pozitif olan mikroglia sıralamak için kullanılır. Başarılı izolasyon tüm canlı tek hücrelerden en azından kortikal doku için% 80'den fazla mikroglia üretmelidir.
Bireysel mikroglia lysis tamponuna yakalandıktan sonra, RNA serbest bırakılır ve daha sonra cDNA'ya aktarılır ve daha sonra 23 döngü boyunca yükseltilir. Bir kılcal elektroforez platformu olarak, parça analizörü ve yüksek duyarlı NGS parça kitleri boyut dağılımı hakkında hızlı ve doğru bilgi sağlar, yanı sıra 96-kuyu plaka her kuyuda bulunan cDNA moleküllerinin miktarı. 500 ile 5,000 baz çifti arasında bir yayma gösteren ve belirli bir konsantrasyon eşiğinin üzerinde olan örnekler kütüphaneler yapmak için kullanılabilir.
Örnekler, tek hücreli RNA sıralama metodolojisinin algılama gücünü doygunlaştıran hücre başına bir milyondan fazla ham okuma derinliğine sıralanır. 2 üzerinden yaklaşık% 60 bir haritalama oranı ile, mikroglial hücre başına 000 genler tespit edilebilir. Bu izolasyon yönteminden elde edilen daha önce yayınlanmış veriler bağımsız deneylerden üretilir ve sıralı popülasyonda mikroglia spesifik genlerin saptanma hassasiyetini gösterir.
Tek mikroglia transkripsiyonları bilgi ile, araştırmacılar kendi ilgi bağlamında benzersiz hücre popülasyonları keşfedebilir, ve daha fazla bu yeni tanımlanan popülasyonların işlevsel alaka çalışma.
