تم تصميم بروتوكولنا للتحقيق في الآليات الفيزيائية الحيوية التي تحكم نقل البضائع من قبل فرق من البروتينات الحركية السيوتو الهيكلية المتطابقة أو الموجهة عكسًا. باستخدام الحمض النووي اوريغامي للبناء الجزيئي، يمكن لهذه الطريقة اختيار لنوع، عدد، وموقع المحركات على أشكال الشحن محددة بدقة. في حين أن هذا البروتوكول يركز على المحركات القائمة على microtubule dynein و kinesin ، فإنه قابل للتكيف مع الميوسين المحرك القائم على actin ، وكذلك إلى أنظمة البروتين الأخرى التي تعمل بشكل تعاوني.
أحد الجوانب الصعبة لهذا البروتوكول هو الحفاظ على سلامة ونشاط البروتينات الحركية طوال عملية التنقية ، حيث أنها حساسة للحرارة والقوة الميكانيكية. للحث على نمو البروتين الحركي والتعبير عن طريق مروج galactose ، استخدم عصا تلقيح عقيمة لتسطط سلالة الخميرة المجمدة من الاهتمام على لوحة ثقافة الخميرة - بيبتون - ديكستروز لاحتضان لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام في 30 درجة مئوية. في اليوم الرابع من الثقافة ، عندما تكون الكثافة البصرية في 600 نانومتر بين 1.5 واثنين ، وجمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تثبيت بيليه في الماء لغسلها وتوحيد الخلايا في زجاجة واحدة.
تدور الخلايا مرة أخرى لجمع، وإعادة تعليق بيليه في حوالي ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة. ثم استخدام ماصة 10 ملليلتر لصرف ببطء الطين الخلية في النيتروجين السائل قطرة واحدة في وقت واحد لإنتاج كريات خلية الخميرة المجمدة. لتنقية البروتين الحركي، استخدم طاحونة قهوة من نوع الشفرة مبردة مسبقًا مع النيتروجين السائل لطحن كريات الخميرة المجمدة إلى مسحوق ناعم، ونقل مسحوق الخميرة إلى كوب زجاجي مُبرد مسبقًا و100 ملليلتر على الجليد.
إضافة حجم صغير من عازلة تحلل 4X أعدت حديثا مع ملاحق للمسحوق بحيث لا يتجاوز التركيز النهائي من العازلة 1X، ووضع الكأس في حمام الماء 37 درجة مئوية مع اثارة مستمرة مع ملعقة لذوبان المسحوق بسرعة. إضافة 4X إضافية العازلة مع المكملات لتحقيق تركيز المخزن المؤقت النهائي إلى 1X في lysate. وغالبا ما يكون حجم النهائي بين 25 و 30 ملليلتر.
ثم جمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي، ونقل البروتين القابل للذوبان التي تحتوي على عظمى في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر على الجليد. لتنقية التقارب IgG، إضافة 200 ميكرولتر من تعليق حبة تقارب غسلها إلى مستخلص البروتين، واحتضان الخليط في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة مع تناوب لطيف. في نهاية الحضانة، تصفية الخليط من خلال نفس العمود الكروماتوغرافيا المستخدمة لإعداد الخرز في أربع درجات مئوية، تليها اثنين من يغسل مع خمسة ملليلتر من غسل العازلة لكل غسل على الجليد.
بعد الغسيل الثاني ، شطف الخرز على الجليد مع خمسة ملليلتر من العازلة TEV ، مما يسمح للمخزن المؤقت باستنزف بالكامل من العمود. لوضع العلامات على oligonucleotide الحمض النووي ، قم بغطاء عمود الكروماتوغرافيا ، واحتضان الخرزات الحركية مع 100 ميكرولترات من العازلة TEV المكملة مع 10 إلى 20 ميكرومولار من القلة البنزيلجوين المنقى في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، وإعادة بناء الخرز بلطف مرة واحدة في الدقيقة. في نهاية الحضانة، وغسل الخرز أربع مرات مع عازلة TEV الطازجة في غسل كما هو موضح للتو، قبل recapping الجزء السفلي من الأنبوب للسماح resuspension من الخرز المحرك في ما لا يزيد عن 200 ميكرولترات من عازلة TEV الطازجة.
بالنسبة لشق TEV ، قم بنقل تعليق الخرزة الحركية إلى أنبوب 2 ملليلتر ، مستدير القاع ، ميكروسنتريفوج ، واحتضان الخرزات الحركية مع ما يقرب من 0.3 وحدة من TEV protease لكل ميكرولتر من خليط حبة المحرك عند 16 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع دوران لطيف. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي الخرز المحرك، وجمع الخليط في الجزء السفلي من الأنبوب. بعد ذلك، استخدم طرف ماصة P1000 المقطوعة لنقل الخليط إلى عمود الدوران، والطرد المركزي الخليط كما هو موضح للتو.
جمع الترشيحات التي تحتوي على TEV-مشقوق، والمحركات المنقية، و aliquot filrate في 50 ميكرولتر وحدات التخزين لتنقية التقارب. ثم فلاش تجميد aliquots في النيتروجين السائل للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. لتنقية الهيكل، في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم قبل تنقية، طبقة بلطف 80 ميكرولتر كل من تركيز الجلسرين في عازلة طي اوريغامي في أنبوب الطرد المركزي.
يجب أن تكون الحدود بين الطبقات مرئية بشكل طفيف. بعد حضانة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية, طبقة 10٪ الجلسرين في عازلة طي اوريغامي في حل هيكل مطوية على الطبقة العليا من التدرج, والطرد المركزي التدرج مع الهيكل. في نهاية الطرد المركزي، وجمع 50 ميكرولتر الكسور من التدرج في اتجاه من أعلى إلى أسفل، وتحميل خمسة ميكرولترات من كل كسر في آبار فردية من هلام agarose 2٪.
بعد 90 إلى 120 دقيقة في 70 فولت، صورة هلام باستخدام ظروف مناسبة لطخة هلام الحمض النووي المستخدمة. ويمكن تحديد التركيزات الكمية للكسور المختارة من الفائدة باستخدام الطرق الطيفية القياسية المناسبة. يمكن استخدام تحليل SDS-PAGE لتأكيد النجاح في استخراج الدينين من الخميرة ، حيث يظهر filtrate النهائي نطاقًا واضحًا وحاداً بسرعة 350 كيلو دالات تقريبًا.
TEV protease هو أيضا موجود في الترشيح النهائي ويشكل شريط واضح في حوالي 50 كيلودالتون. بعد تنقية التقارب microtubule، dynein يظهر كضفيرة واضحة، واحدة في 350 كيلودالون، في حين يمكن ملاحظة kinesin كما تلطيخ قليلا، وعصابات متعددة في حوالي 120 كيلودالتون. بالإضافة إلى بروتياز TEV ، يمكن أيضًا ملاحظة كمية ملحوظة من التبولين في المُنَافق النهائي.
يمكن تحليل طي هياكل اوريغامي الحمض النووي بواسطة agarose هلام electrophoresis ، مع تحول في التنقل بين حبلا السقالات النقية المتكشفة ورد فعل قابل للطي يشير إلى طي اوريغامي. بالإضافة إلى ذلك، يشير رد الفعل القابل للطي إلى وجود بعض الهياكل المتعددة للهيكل. حركة مجموعات الهيكل الحركي يمكن اكتشافها بسهولة وقابليتها على الكموغرافيات المتولدة من أفلام TIRF ، حيث أن كيموغرافيات الهيكل المرنة المترافقة مع سبعة بروتينات dynein تظهر أشواطًا عملية للغاية بسرعات ثابتة نسبيًا.
من المهم التحكم بعناية في درجة حرارة البروتينات الحركية في كل خطوة من العملية. بعد تنقية البروتينات الحركية وهيكل اوريغامي الحمض النووي، يمكن أن يكون مكونين مترافقة لمقارنات الحركة من الفرق تحت مجهر TIRF. هذه الطريقة تمكن من الآليات البيوفيزيائية والكيميائية الحيوية التي تحكم الحركة الناشئة من الفرق الحركية أن فك رموزها.
